醋酸纤维薄膜电泳试验技术的探讨-血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.docx

醋酸纤维薄膜电泳试验技术的探讨|血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 　　[摘要] 醋酸纤维薄膜电泳因为操作简便、分辨力高和电泳时间短等优点,在很多方面被广泛应用同时,醋酸纤维素薄膜电泳也被列为生物化学试验教学中的经典试验之一本文依据多年来学生试验中电泳图谱不理想的情况,特重现学生常常出现的错误操作,从而和正确的操作得到的图谱进行对比,方便为以后得到的不理想图谱提供分析依据　　[关键词] 醋酸纤维薄膜 电泳 电泳图谱　　电泳是生物化学的基础技术电场力、微粒同支持介质相互作用、热运动扩散、缓冲液流动等对蛋白电泳的运动方向和速度全部有影响多个原因可引发缓冲液流动,电流引发的缓冲液流动称为电渗但通常电场力决定蛋白质电泳行为,缓冲液流动对蛋白质电泳行为的影响太小而难观察到血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳广泛用于临床检验和电泳的试验教学正常条件下血清蛋白点样线靠近阴极端试验过程中,很多试验者因不清楚点样方法、点样位置等,从而引发试验效果不够显著本文设计一系列试验,对试验结果进行对比分析,并验证其原因,以期提升学生试验的成功率及电泳效果　　一、验器材及试剂　　1.器材　　DYY-5型稳压电泳仪、DYY-Ⅲ38B电泳槽、醋酸纤维素薄膜、新鲜鸡血清、滤纸、盖玻片、烧杯、量筒、容量瓶等。

　　2.试剂　　巴比妥缓冲液;染色液;漂洗液　　二、试验方案及方法　　1.试验方案　　因为本试验过程中细微操作较多,现就试验中轻易出现错误操作的步骤,设计了6个平行试验:对照:正确操作;倾斜点样;在光滑面点样;正确点样、搭桥时光滑面向下;将浸润的薄膜吸干再点样;正确点样、倾斜搭桥　　2.试验方法　　制作血清　　用加有抗凝剂的一次性注射器抽取适量鸡血液,离心,得到新鲜鸡血清,放入4℃冰箱保留待用　　滤纸桥的制做　　依据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸适宜的滤纸条在两个电极槽中各倒入适量体积的缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放一层滤纸条,使滤纸一端的长边和支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液中当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上　　醋酸纤维薄膜的润湿和选择　　用镊子取一膜条,在据一端处画一条直线以后,小心地平放在盛有缓冲液的培养皿中若漂浮于液面的膜条在15~30秒内快速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜条均匀,即可用于电泳;若膜条润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果将选好的膜条用镊子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约5~10min后方可用于电泳。

　　点样　　用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多出的缓冲液无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边和模板底边对齐,在铅笔划线处点样点样时用盖玻片轻轻地印在点样区内并随即提取,使血清完全渗透于膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线　　电泳　　用镊子将点样的一端平贴在负极电泳槽支架的滤纸桥上,无光泽面朝下,另一端平贴在正极端的支架上为了使膜条和电场平行,把膜条和电极之间压严,使膜条绷直,中间不下垂如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距1~3mm,使之不相互接触,以免相干扰盖严电泳室,平衡10min后方可通电先调整粗调旋钮,然后调整细调旋钮开始将电流强度调至/cm膜宽,10min后调至/cm膜宽,60min后停止电泳　　染色　　电泳完成,立刻取出薄膜,直接浸入染色液中染色5��~�10min　　漂洗　　将膜条从染色液中取出后,移置到漂洗液中漂洗约5次,至无蛋白区底色脱净为止取出薄膜放在滤纸上,自然风干　　结果观察　　三、结果和分析　　下图为相同电泳条件下,根据不一样操作方法所取得的电泳图谱:　　正确操作;倾斜点样;在光滑面点样;正确点样、搭桥时光滑面向下;将浸润的薄膜吸干再点样;正确点样、倾斜搭桥。

　　1.倾斜点样　　经过几次试验的结果,对比1号、2号薄膜,我们发觉,倾斜点样得到的谱带和正确操作得到的谱带并无太大差异试验结果似乎表明,倾斜点样对最终取得的电泳谱带并无太大影响,这应该是让我们快乐的事情可是这一结果却和带电颗粒在电场中的理论移动行为相悖离,也就是说一样的带电颗粒在同一电场中的移动速度不一致为何出现这一现象还需要大量试验和深入分析　　2.在光滑面点样　　经过试验结果拍摄的图片,对比1号、3号薄膜,我们发觉,3号薄膜后落下了长长的尾巴,也就是出现了所谓的拖尾现象,因此血清点在光滑面是一个很严重的错误因为薄膜光滑面为一层薄薄的聚乙烯,使得血清不能完全浸到粗糙面的乙酸纤维素内,电泳过程中同种血清蛋白流动也不一致,严重影响了试验结果　　3.光滑面向下搭桥　　经过1号、4号的对比,可见光滑面向下搭桥电泳出的条带即使区分不清楚,但仍能模糊分出5条带,只是条带之间的间距比正确操作得出的结果小的多这是因为光滑面向下时,因为聚乙烯薄膜的阻挡作用,使经过薄膜的电流减小,血清蛋白流动变慢,从而造成了条带间距变小,试验结果也所以变得不理想　　4.浸润的薄膜吸得太干　　1号和5号对比能够发觉,薄膜太干造成条带难以分离,只出现了3条带。

因为薄膜被吸的太干,电泳时电流不轻易经过薄膜,被吸在薄膜上的血清蛋白也难以在薄膜上流动而难以分离,从而难以出现5条显著谱带　　5.搭桥时倾斜放置　　带电的蛋白质离子在电场中是沿着电场的方向流动的,当薄膜倾斜时,理论上会向着薄膜长形的一条边聚集,然后再沿着边向阳极移动因此6号薄膜电泳出的条带应该还是和点样线平行的,只是越靠近阳极条带越窄,和的信号显示差不多　　试验结果显示,6号薄膜仍能区分出5条谱带,除第一条条带有部分倾斜外,其他四条还是和点样线平行的电泳谱带并没有像预期的那样向薄膜的一边聚集这和倾斜点样一样,和理论有一定的出入,二者倒是全部和薄膜的长轴方向一致,详细原因还需深入的分析和验证　　四、讨论　　用醋酸纤维薄膜作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、分辨能力强、没有吸附现象、便于保留等优点不过因为操作不妥、试验条件等原因,试验结果往往不够理想另外,我们还发觉,倾斜点样、倾斜搭桥对试验结果影响不显著,但该结果和理论分析相悖对这一问题还需要深入试验和探讨。