玉郎伞多糖的分离纯化和组成性质研究.doc

1玉郎伞多糖的分离纯化和组成性质研究作者：林兴 蒋伟哲 焦杨 张士军 李江 黄仁彬【摘要 】 目的从玉郎伞(YLS)中分离出玉郎伞多糖，并对其化学组成进行研究方法 YLS 经醇提后的药渣用热水提取，乙醇沉淀，Sevag 试剂脱蛋白，采用 DEAE 纤维素（DEAE 52 ）柱层析分离纯化，气相色谱和薄层色谱分析其组成结果分离得到的 YLS 多糖经Sephadex 75凝胶柱层析，硫酸-苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法(HPGPC) 证实为单一多糖，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成结论 YLS 多糖首次从 YLS 中提取获得，为 YLS 主要成分之一 【关键词】 玉郎伞 多糖 分离纯化 组成玉郎伞（YLS）原植物经考证为蝶形花科植物疏叶崖豆 Millettia pulchra Kurzvar laxior (Dunn) Z. Wei 的块根民间常用于高血压病、跌打损伤和风湿病的治疗，也用于治疗智力减退、消化不良、营养不良和病后虚弱等药理实验表明，YLS 多糖能明显延长小鼠游泳时间、耐缺氧时间及耐高温时间，显著提高小鼠血清 SOD、GSH Px活性及减少 MDA 含量，具有较好的抗衰老作用［1 ］ 。

本实验对YLS 多糖作了分离纯化并对其组成性质进行研究现报道如下21 材料与仪器1.1 材料与试剂玉郎伞饮片，购于南宁医药公司；D  木糖，生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司，批号 011130；L（＋）－鼠李糖，生化试剂，北京化学试剂公司，批号 011204；阿拉伯糖，生化试剂，武汉生命技术有限公司，批号 030625；葡萄糖，分析纯，上海伯奥生物科技有限公司，批号 030305；D（＋）半乳糖，生化试剂，sigma ，批号 B002211DEAE Cellulose 52, whatman 批号 010410；Sephadex G 75， pharmacia,　批号：279867；胰蛋白酶，美国 sigma，批号 030409用于气相色谱分析的试剂均为色谱纯，其余试剂为分析纯1.2 仪器 1525 WATERS 高效液相色谱仪，美国 WATERS 公司；4890D 气相色谱仪，美国 Agilent 公司；TU 1800SpC 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司2 方法2.1 粗多糖的提取 玉郎伞饮片粉碎后，加 70%乙醇回流提取除去脂溶性杂质，药渣加蒸馏水煮 3 次，3 h/次，合并滤液，离心分离，浓缩至适当体积，加入 5 倍量 95%乙醇，醇析 24 h，过滤，3依次用 95%乙醇、丙酮洗涤多次，沉淀物加蒸馏水溶解，加入适量胰蛋白酶，摇匀，37 ℃水浴保温 12 h，采用 Sevage 法除去蛋白［2］ ，药渣用蒸馏水溶解，透析 48 h，除去小分子杂质及色素，透析后浓缩至适当体积，加 5 倍无水乙醇，醇析 8 h，收集沉淀物，真空干燥得 YLS 粗多糖。

2.2 多糖纯化 YLS 粗多糖适量，加蒸馏水溶解，上已处理好的DEAE 52纤维素（OH  ，400 mm×26 mm）柱层析，用蒸馏水洗脱，流速 1 ml·min-1，分部收集，每管 5 ml，用硫酸  苯酚法显色［3，4］ ，收集合并含糖洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干洗脱液，得白色 YLS 多糖2.3 多糖的纯度鉴定紫外光谱：取上述分离纯化后的多糖，配成 0.1%水溶液，在TU 1800SpC紫外可见分光光度计对 200～400 nm 区间扫描凝胶柱层析：YLS 多糖经 Sephadex G 75柱层析，蒸馏水洗脱，流速 0.1 ml/min，每管 1 ml 分部收集，苯酚  硫酸显色，以管号为横坐标，光密度为纵坐标，根据分部收集中出现的峰数和形状断定多糖的纯度4高效凝胶渗透色谱法(HPGPC) ［5］：美国 Waters 高效液相色谱仪，2410 示差折光检测器（附加 GPC 软件） 色谱柱为日本TOSOH 公司 TSKgel G3000 pWxl 凝胶色谱柱(300 mm×7.8 mm)，流动相为 0.7%硫酸钠水溶液，流速 0.6 ml·min-1，柱温 35 ℃，进样量 20 μl。

2.4 多糖的组成分析薄层色谱分析［6 ，7］：　将 60 mgYLS 多糖加入 8 ml 2 mol·l-1 的硫酸中，加入 N2 除 O2 封管， 105 ℃烘箱中水解 8 h，水解液用饱和 Ba(OH)2 溶液中和，离心去除 BaSO4 沉淀，上清液减压浓缩至干，得多糖水解物备用取 1%的多糖水解物于高效硅胶 G 薄层板（ 10 cm×20 cm）上点样，以标准单糖为对照展开系统：醋酸乙酯∶异丙醇∶ 乙酸∶水＝11∶4∶4∶1 （V/V ）显色：10%硫酸乙醇溶液，喷雾后于 105 ℃加热 10 min气相色谱分析［4 ，6，8］：取上述水解多糖 30 mg 按下列步骤进行，加入 30 mg 盐酸羟胺和 1.0 ml 吡啶于 90 ℃恒温水浴中振荡，加热反应 30 min，取出冷却至室温，加入 1.0 ml 醋酸酐，于 90 ℃恒温水浴中乙酰化 30 min，生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物反应产物用旋转蒸发仪蒸干，残渣用 2 ml 氯仿溶解，取样，5进行气相色谱分析，以标准单糖衍生物为对照色谱条件：Hp Agilent 4890D 气相色谱仪色谱柱为石英毛细管柱 Hp 5（0.53 mmid×15 m） ；FID 检测器（氢火焰） ；柱室温度 200 ℃；气化温度 270 ℃；燃气 H2，0.22 MPa；载气N2，0.19 MPa，空气助燃 0.30 MPa；进样量 1 μl；程序升温，开始时，150 ℃保持 1 min，接着以 5 ℃·min-1 升至 200 ℃，并于200 ℃ 保持 10 min。

3 结果分离纯化得到的 YLS 多糖呈白色粉沫，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂3.1 紫外光谱分析 YLS 多糖在 250～280 nm 之间无吸收，说明其中无蛋白质、氨基酸及核酸(见图 1)3.2 凝胶柱层析洗脱曲线为单一洗脱峰，表明所得多糖纯度较高(见图 2)3.3 HPGPC 测定结果 在图谱中只有单一峰，证明纯度较高（见图 3） 63.4 薄层色谱分析见图 4在薄层板上从左至右依次为木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和 YLS 多糖水解样品（有两个斑点，分别表示为 YLS R1 和 YLS R2） 结果表明，玉郎伞多糖主要由葡萄糖和阿位伯糖组成（各糖 Rf 值见表 1） 表 1 YLS 多糖水解物和标准单糖的 Rf3.5 气相色谱分析 YLS 多糖水解物在气相色谱上出现两个峰，其保留时间分别为 9.456 min 和 14.980 min，与阿拉伯糖和葡萄糖的保留时间一致(见图 5～6)，说明 YLS 多糖是由阿拉伯糖葡萄糖两种糖组成，与薄层色谱的结果相符，其百分组成（面积归一化法）见表 2表 2 YLS 多糖成分单糖百分组成4 讨论本实验利用较为常规的方法提取 YLS 多糖，经 DEAE 52和Sephadex G 75分离纯化，紫外、凝胶柱层析、气相色谱分析，证明所得多糖纯度较高，并首次证实 YLS 多糖是由葡萄糖和阿拉伯糖组成。

YLS 中多糖含量多，作用广泛，具有较高的研究和开发价值参考文献】7［ 1］ 黄忠仕，黄仁彬，林 兴,等. 龙眼参粗多糖抗衰老作用的实验研究［J］. 中华现代中西医杂志，2004，2（2 ）:97.［2］ 张国升，樊明月，张佳美，等. 　芦根多糖的提取及含量测定［J］. 安徽中医学院学报，2002,21(1):51. ［3］ 贡济宇，于 波，于 澎，等. 酚硫酸法测定灵芝多糖含量的实验研究［J］. 长春中医学院学报，2002，18（1）:45.［4］ 程荷凤，蔡 春，李小凤.　化橘红多糖的分离纯化及其组成的气相色谱分析［J］. 广东医学院学报，1998，16（1）:15.［5］ 吕志华，于广利，赵 峡, 等. 不同标准品对 HpGpC 法测定多糖相对分子质量的影响［J］. 中国新药杂志，2002， 11（3）:220.　［6］ 程 霜，冯泽静. 冬瓜多糖的分离与鉴定［J］. 粮油加工与食品机械，2002，9 ：44.［7］ 商 澎，杨铁虹，贾 敏，等. 当归多糖的分离、纯化及分析鉴定［J］. 第四军医大学学报，2001,22(14)：1311.8［8］ Hostettmannk,MarstonA (赵维民等译). 制备色谱技术 在天然大分子物分离中的应用［M］. 北京:科学出版社，2000：256.。