项目十六 免疫细胞的分离（仅供参照）.doc

项目十六 　免疫细胞的分离一、抗凝血的制备 【实验原理】　　常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法　　【试剂和器材】　　1．试剂　肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等　　2．器材　三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具　　【步骤和方法】　　1．肝素抗凝法　　将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果　　2．EDTA法　　常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液　　3．脱纤维法　　在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。

　　4．Alsever液抗凝法　　血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2　　【结果判定】　　除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备　　【注意事项】　　1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌　　2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止常采用旋转混合的方法混匀　　3．抗凝血放4℃保存　　【方法评价】　　肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周　　【临床意义】　　抗凝血的制备是实验室常用的基本技术之一，在免疫试验及血细胞的检测中被广泛利用，是医学检验专业学生必须掌握的基本技能之一　　【思考题】　　1．实验室血液抗凝法有哪些？抗凝的原理如何？　　2．不同抗凝法有何特点？试设想不同试验中应如何选择抗凝方法？　　 二、外周血中免疫细胞的分离(Extrication of immunocyte from peripheral blood)　　(一) 白细胞制备　　 【实验原理】　　血液中白细胞的分离方法常用自然沉降法或利用高分子聚合物加速红细胞沉降的方法来分离白细胞。

因血液中红细胞的密度比其它血细胞密度大，故红细胞沉降率较快，而且高分子聚合物能使红细胞凝聚成串钱状，加速其沉降，故而从血浆层中可分离到白细胞　　只介绍60g/L右旋糖酐沉降法　　【试剂和器材】　　1．60g/L右旋糖酐　取右旋糖酐(dextran，分子量200～400kDa)6g，加生理盐水至100ml溶解，115℃灭菌15min，备用　　2．其它试剂　无Ca2+、Mg2+ Hanks液　　3．器材　试管、吸管、吸头、离心机等　　【步骤和方法】　　 取适量抗凝血加入等量60g/L右旋糖酐，轻轻混匀，直立或45°角倾斜，置室温或37℃ 30min取出血浆层，用无Ca2+、Mg2+ Hanks液洗涤3次，每次2000r/min离心10min按实验要求配成所需浓度，通常为2×106个细胞/ml　　【结果判定】　　 此法分离的白细胞中含60%~70％的淋巴细胞，同时也含较多的粒细胞、单核细胞、血小板及少量的红细胞　　【注意事项】　　1．加速沉降时间不能超过30min，自然沉降时间不能超过60min，否则淋巴细胞也会沉积，使收获率降低　　2．混杂的红细胞可用NH4Cl溶液溶解，离心去除　　3．吸取血浆层时，也可将红细胞层上的白细胞层收获，虽然白细胞收获率高，但是红细胞的污染率也增高。

　　【方法评价】　　加速红细胞沉降的方法除本法之外，还有30g/L明胶生理盐水、35g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量25kDa)生理盐水、或10g/L甲基纤维素等分离方法这些方法简便，细胞收获率比自然沉降法高明胶沉降法会增加白细胞粘性，对实验有一定影响自然沉降法所得细胞损伤最小　　【临床意义】　　沉降法制备的白细胞悬液，可用于许多细胞免疫试验，但是由于悬液中含中性粒细胞、血小板及红细胞较多，因此在淋巴细胞增殖试验、组织配型等试验中不宜使用，否则会使结果出现较大误差，甚至出现错误也可进一步用于其它免疫细胞的分离　　【附】　红细胞溶解(NH4Cl)法　　1．NH4Cl溶解缓冲液配制　　　　 NH4Cl 8.29g (或8.3g) KHCO3 1.09g (或1.0g) EDTA-Na2 37.0mg 蒸馏水加至100ml，溶解后置2~8℃保存用时用PBS(配制：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·7H2O 2.16g，NaCl 8g，NaN3 0.5g，蒸馏水1000ml；0.01mol/L)或蒸馏水稀释10倍，pH在7.3~7.4(不在此范围应调整pH)，室温保存，1周内使用，过期作废。

　　2．溶解方法　　(1)按每3~10ml血液分离的白细胞悬液加入5ml NH4Cl溶解缓冲液比例混合(如直接溶解血液中红细胞应按0.5~1ml血液加入14ml溶解液比例混合)　　(2)置室温3~5min，然后立刻离心，离心速度1000~2000r/min，离心时间应小于10min，去上清　　(3)用Hanks液(或其它缓冲液、培养液)至少洗涤１次，按实验要求配制成所需浓度　　注意溶解时间不要超过5min，否则会有部分白细胞破坏；溶解后立刻离心，洗涤 【思考题】 加速红细胞沉降的方法有哪些？其原理如何？(二) 单个核细胞制备　　【实验原理】　　血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法(density gradient centrifugation)单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，人外周血单个核细胞的密度为1.050~1.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.080~1.110利用密度为1.077±0.001的分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮于分层液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底　　【试剂和器材】　　1．聚蔗糖-泛影葡胺分层液(密度为1.077±0.001) 已有商品供应或自己配制。

　　2．5g/L台盼蓝　配制方法见附录Ⅲ　　3．肝素　250U/ml溶液，用Hanks液配制　　4．Hanks液　　5．刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片　　6．水平离心机、显微镜步骤和方法】　　1．取静脉血2ml，加0.2ml肝素溶液抗凝，作白细胞计数和分类计数之后，再加入等量Hanks液，混匀　　2．取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面稀释血液与分层液的容积比例以2:1~3:1为宜　　3．置水平离心机中离心2000r/min 20min4．离心后从离心管底部到液面分为五层，依次为红细胞沉淀层、粒细胞层、分层液层、白雾状单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)，见图3-1图3-1 聚蔗糖-泛影葡胺分层液离心后外周血细胞分布示意图　　5．用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸出该层，置于另一离心管中　　6．加入5倍量以上的Hanks液，充分混匀，离心1000r/min 10min离心后倾弃上清液，再用Hanks液洗涤2次　　7．用含10％~20％灭活小牛血清的Hanks液或培养液配制细胞悬液计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝染色检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。

　　【结果判定】　 1．细胞回收率(％)＝[分离后所得细胞悬液量(ml)×悬液中单个核细胞数/ml]/ [原全血量(ml)×原全血中单个核细胞数/ml]×100％　　2．淋巴细胞纯度(％)＝分离后淋巴细胞总数/分离后白细胞总数×100％　　【注意事项】　　1．温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度故应在室温(18~28℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温　　2．分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁　　3．将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果　　4．分离时的转速与时间应根据不同标本作相应调整离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间；若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或缩短离心时间　　【方法评价】　　本方法操作简便、稳定细胞回收率达80％~90％，单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90%~95％，细胞活力可达95％以上但其中仍可混杂少量(约10％)其它细胞　　【临床意义】　　该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。

故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一　　【附】 聚蔗糖-泛影葡胺分层液的配制(密度1.077±0.001)　 1．用双蒸水将400g/L葡聚糖(Ficoll，分子量400kDa)溶液或干粉配成60g/L溶液，其密度为1.020　　2．用生理盐水将600g/L或750g/L泛影葡胺(Urografin)配成340g/L溶液，其比重为 1.200　　3．取2份60g/L葡聚糖与1份340g/L泛影葡胺混合　　4．pH应为7.2~7.4；一般偏酸，可用NaHCO3调整　　5．用波美比重计测密度应为1.077±0.001，如超出1.078，用60g/L葡聚糖溶液调节，如低于1.076，用340g/L泛影葡胺溶液调节　　6．过滤除菌，或112℃灭菌15min置4℃保存备用，一般可保存3个月 【思考题】 1．为何常用密度为1.077±0.001的分层液分离人单个核细胞？ 2．利用密度梯度离心法分离人单个核细胞，为何要将血液标本进行适当稀释，并要叠加于分层液上？　　(三) 淋巴细胞与单核细胞的分离　　【实验原理】　　单核细胞有粘附玻璃和塑料表面的特性，而且它的密度与血液中淋巴细胞、粒细胞、红细胞不同，故可利用粘附法或连续密度梯度离心法使单个核细胞悬液中的淋巴细胞和单核细胞分离、制备。

　　此处只介绍平皿粘附法　　【试剂和器材】　　1．试剂　RPMI 1640培养液(含20％灭活新生牛血清)、EDTA液(1mmol/L)　 2．器材　CO2培养箱(或烛缸)，倒置显微镜(或普通显微镜)、离心机、离心管、 吸管、滴管、玻璃平皿、血球计数板　　【步骤和方法】　　1．将聚蔗糖-泛影葡胺分离的单个核细胞洗涤3次，用RPMI 1640培养液悬浮细胞，计数，将细胞浓度调整到(2~4)×106个细胞/ml　　2．将细胞悬液倾注入足够大面积的无菌平皿中，于37℃5％C。