转化生长因子-β1在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化中作用探析.doc

转化生长因子-B 1在博莱霉素诱导大鼠肺纤维化中作用探析【摘要】目的研究转化生长因子-Bl (TGF-B1)在 肺纤维化大鼠肺内表达的动态变化方法18只雄性Wistar 大鼠被随机平均分为3组，每组6只，其中1组作为正常对 照组(N组)，气管内滴入生理盐水，另外2组气管内滴入博 莱霉素(BLM)后形成肺纤维化模型，分别滴入博莱霉素后 第7、28天处死(Fl、F2组)，观察肺组织病理学变化，免 疫组化法和定时定量PCR法检测TGF-B 1的表达结果肺 纤维化模型组中，TGF-B1表达较正常组有明显升高 (P<；O. 05 )，而Tl、T2组间表达无明显区别 (P>；0. 05) ,TGF-P1蛋白主要表达在肺泡巨噬细胞，肺 泡上皮细胞及肺间质中结论TGF-B 1升高与肺纤维化发生 发展关系密切，而在肺纤维化形成过程中TGF-I3 1变化不明 显关键词】肺纤维化大鼠转化生长因子-B1The role of t ransforming fac tor■- Bl in the progression of pulmonary fibrosis induced by bleomycin in ratsZHU Gang,ZHOU Long-nv,ZHANG Zhi-ling. Department ofEmergency,Shemghdi Ninth People? s Hospital,Shanghai Jiaotong University‘School of Medicine,Shanghai 200127,China[Abstract】 Objective To investigate the expression of transforming factor~ 3 1 (TGF-B 1) in this course of pulmonary fibrosis in rats・Methods Eighteen maleWistar rats were divided into three groups,one groupe as normal group (N group)・ The other 2 groups were injected bleomycin to tracheae・ Lungs were harvested from rats at 7、28day (Fl、F2 group)・ His to logical staining was used to emalyses the pathological changes of lung .The mRNA expression of TGF~ P 1 was det ermined by the methods of real-time PCR and immunohistochemistry. ResultsThe expression ofof pulmonary fibrosis・ The protein ofTGF—B 1 was found inTGF-B 1 increased in the modelsepithelium and lungalveolar macrophage,alveolar mesenchyma.Conclusion The increase of TGF—Bl has an important effect on the course of pulmonary fibrosis in pathology.[Key words] pulmonary fibrosis；rat；TGF-3 1 肺纤维化是尘肺、肉芽肿性间质性肺病以及纤维化间质性肺病的共同转归。

多种细胞因子在肺纤维化过程中发挥着 重要作用，促进和抑制肺纤维化相互拮抗，转化生长因子 -Bl （TGF-B1）在刺激细胞间基质的积聚过程中发挥尤为 重要作用笔者观察了博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化过程中 TGF-B 1的表达，研讨其在肺纤维化过程中的作用1材料与方法1. 1材料Wistar大鼠清洁级，体重200〜250g,购自上 海必凯有限公司1. 2方法1.2. 1分组18只雄性Wistar大鼠被随机分为3组，每 组6只其中1组作为正常对照组（N组），另外2组气管内 注入BLM 5mg/kg,正常组气管内滴入等量生理盐水在气管 内滴药后第7, 28天每组各处死6只动物（Fl、F2组）1.2.2病理学检查3组大鼠肺组织经苏木精-伊红（HE） 染色切片，肺纤维化诊断标准按文献【1】的标准按Szapiel 等【2】方法评价肺泡炎及肺纤维化的程度1.2.3免疫组化（SABC）方法测定肺组织中TGF-B 1蛋 白质的表达1. 2. 4 TGF- B ImRNA 的即时定量 RT-PCR1.2.4. 1 TGF-B 1 及 0-actin 引物序列 TGF-B 1 （ + ） 5, GCT TGA ACC CAA GGA GAC CGGAATA3 '（- ） 5 'ACCTCGACGTTGGGACTGA 33-actin ( + )5’ CCTCTATGCAACACAGTGC 3 ' （-）5’ATACTCCTGCTTGCTGATCC3'。

1・2・4.2样品的RNA抽提按RNA提取盒操作，溶于20 ul RAase-free 水-70°C保存1.2. 4. 3使用样品的RNA进行cDNA合成加10 u 1的RT 反应液（RNA5ug, 3. 5uMoligo （dT）引物 1 ul 加样品的 RNA 至10 u 1）到10 U 1退火混合物（5XRT缓冲液4 n 1 2. 5mMdNTP 混合液4U1RNA酶抑制剂1 H 1MMLV反转录酶lul）中，37匸 水浴60min,加热到95°C维持5min,得RT终溶液即位cDNA 溶液，置冰浴待用1.2. 4.4实时定量PCR反应（1）制备用于绘制标准曲 线的梯度稀释DNA模板：反应体系为10XPCR缓冲液 2.5ul,MgC12溶液l・5ul,20uM的PCR特异引物 10. 5 u 1,20uM 的 PCR 特异引物 20. 5 u 1, dNTP 混合液 3ul, Taq聚合酶3u, cDNA 1 u 1加水至总体积25 nl, 45个PCR 循环（94°C,20s；退火温度，20s； 72°C,30s）； 72°C延伸 5mino 将PCR产物进行10倍梯度稀释2）几个梯度稀释的DNA 模板以及cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系： 10XPCR 缓冲液 2.5U1, MgC12 溶液 20 u M 的 PCR 特异引物0.5U1,20 UM的PCR特异引物0.5U1,dNTP混合液 3 u 1, Taq 聚合酶 3u, Sybergreen 终浓度 0. 25X , cDNAorDNA 1 u 1 加水至总体积 25ul, TGF_B 194°C5min；40 个 PCR 循环[94°C, 20s；56°C, 20s；72°C, 20s； 83. 5°C （收集荧光），10s]； B-actin94°C5min； 40 个 PCR 循环【94°C, 20s； 58°C, 20s； 72°C, 20s； 85°C （收集荧光），10s】。

3）结果和计算根据 绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品浓度结果直接由机器 生成，每个样品的基因浓度除以3 -actin的浓度，即为该样 品基因校正后的相对含量1.3统计学处理运用STATPAL统计软件进行t检验，数 据以x + s表示2结果2. 1苏木精-伊红（HE）染色切片结果观察正常对照组 （N组）大鼠无明显病变，实验组大鼠灌注BLM后第7天（F1 组）肺泡炎变化明显，肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，肺 间质内毛细血管增生，第28天（F2组）肺泡炎程度减轻， 肺泡结构破坏，肺泡萎陷，肺间质出现大量胶原纤维和成纤 维细胞2.2免疫组化（SABC）方法测定肺组织右TGF-B1蛋白 质的表达正常对照组大鼠TGF-B1表达不明显，在实验组 大鼠灌注BLM后，TGF-B 1表达在支气管黏膜上皮，支气管 腺体及肺泡巨噬细胞中2. 3 TGF-B ImRNA表达 实验组大鼠灌注BLM后，第7天 （F1组）及第28天（F2组）TGF- P ImRNA表达明显高于正 常对照组（N组）大鼠TGF- 3 ImRNA表达（P<；O. 05） ,F1 组与F2组间无明显区别（P>；0.05）表1 TGF-B ImRNA半定量值比较 注：Fl、F2组相比N组均有显 著升髙（*P<；0.05 ） ；F1组与F2组组间无差别 （**P>；0. 05）3讨论肺纤维化是一组由多种病因引起的肺破坏性疾病，其发 病机制尚未阐明，但一般认为早期为肺炎症及肺损伤，晚期 为细胞外基质（胶原纤维）的沉积。

近年来，对于肺内多种 细胞因子的研究使得肺纤维化机制的研究取得了重要的进 展在参与肺纤维化的细胞因子中，TGF-B是研究最深入、 最重要的细胞因子本实验表明TGF-B1在肺纤维化过程中明显上升，与肺 纤维化显著相关，提示TGF-B 1在肺纤维化过程中有着显著 促进作用，TGF-B1由血小板、巨噬细胞、内皮细胞等产生, 它能促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制 胶原降解，在组织器官的纤维化中发挥了十分重要的作用， 被公认为纤维化形成与发展的启动枢纽，是关键性细胞因 子TGF-B的生物学功能：（1 ）趋化并促进成纤维细胞分 裂增殖及成熟分化；（2）刺激成纤维细胞大量合成胶原蛋白 I、III、IV型，尤其是IV型胶原蛋白，以增加肺间质的胶原 成分，同时又抑制胶原蛋白本科及纤溶酶原激活物的合成， 增加蛋白酶抑制物的形成，以减少肺间质ECM的降解，造成 ECM调节失控；(3)抗炎作用TGF-B 1可通过调节免疫系统 来抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞，同时通过NO产生对巨噬 细胞的细胞毒性；(4)抑制细胞外基质自身的稳定在肺纤维化的预防与治疗中，临床可能通过对TGF-B1 的干预发挥积极作用。

参考文献】1万秋红.TGF-B超家族信号传导机制研究进展.国外医 学•分子生物学分册，2000, 22 (3)： 137.2 Broekelmann T,Limper AH,Colby TV,et al.Transforming growth factor beta 1 is present at sites of extracellular matrix gene expression in human pulmonary fibrosis.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(15) :6642-6646.3 Khalil N,Bereznay 0,Sporn M, et al. Macrophage production of transforming growth factor beta and collagen synthesis in chronic pulmonary inflammatiori. J Exp Med,1989,170 (3) :727-737.4 Zhang K, Flanders KC,Phan SH. Cellular localization of transforming growth factor-betaexpression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis .Am J Pathol,1995,147 (2) ：352-361・5 Awad Mr,El-Game1 A,Hasleton P, et al. Gen。