结核病诊断进展.docx

结核病的诊断第一节结核病的细菌学诊断一、结核分枝杆分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌为杆状，需氧、无芽抱，且不易着色，但经萋-尼 氏(Ziehl-Neelsen)染色呈阳性，故也称为抗酸染色阳性菌(acid-fast bacteria, AFB)分 枝杆菌主要包括结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis-complex, MTC)、麻风 分枝杆菌(Mycobacterium /eprae)和非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria, NTM) o MTC 包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB) > 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis) > 非洲分枝杆菌(africanum )田鼠分枝杆菌(”yco/%c招行〃机 microti)Mtb是引起TB的单一病原菌，可侵犯全身，以肺部感染最为常见1882年Koch发现 结核杆菌，1883年Zopf将结核杆菌命名为Bacterium tuberculosis,至1896年Lehmann与 Neumann将结核杆菌正式命名为Mycobacterium tuberculosisoMtb在分类上隶属于真细菌门、 裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。

Mtb一般多呈细长杆菌，形状稍弯曲，两 端钝圆，长为1〜5|im,宽(厚度)为0.2〜0.6pm,呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、 无芽苑1Mtb细胞壁较一般细菌的细胞壁厚，厚度为10〜35nm,含有大量脂类，具有坚韧 性和疏水性对外界抵抗力较强，在阴湿处能生存5个月以上；但在阳光曝晒2小时，5%〜 12%甲酚皂(来苏)溶液接触2〜12小时，70%酒精接触2分钟，或煮沸1分钟，即可被杀 灭最简便的灭菌方法是直接焚毁带有病菌的痰纸结核菌生长缓慢，增殖一代需15〜20 小时，生长成可见的菌落一般需4〜6周，至少亦需3周结核菌细胞壁含有高分子量的脂肪酸、脂质、蛋白质及多糖类组成的复合成分，而这 些成分大多与其致病力、免疫反响有关在人体内，脂质能引起单核细胞、上皮样细胞及淋 巴细胞浸润而形成结核结节；蛋白质可引起过敏反响，中性粒细胞及单核细胞浸润；多糖类 那么参与某些免疫反响(如凝集反响)结核菌分为人型、牛型及鼠型等种类前两型(尤以 人型，标准菌株H37Rv)为人类结核病的主要病原菌，人型与牛型菌形态相似，对豚鼠均 有较强致病力，但人型菌对家兔免疫致病力那么远较牛型菌为强人型菌可产生烟酸，而牛型 菌的烟酸试验多呈阴性。

饮用未经消毒的带有牛型结核菌的牛奶，可能引起肠道结核感染病灶中菌群常包括数种生长速度不同的结核菌A群：生长繁殖旺盛，存在于细胞外, 致病力强，传染性大，多在疾病的早期活动性病灶内、空洞壁内或人洞内，易被抗结核药物 所杀灭，尤以异烟肺效果最好，起主要杀菌作用，链霉素及利福平亦有效，但不及前者B 群：为细胞内菌，存在于巨噬细胞内，细菌得到酸性细胞质的保护能够生长，但繁殖缓慢, 提取基因组DNA,设计特异性引物，进行核酸扩增LAMP扩增结果经过加入0.1%的SYBR Green I直接用肉眼检测，在紫外光下观测管中溶液的颜色溶液变成绿色的LAMP扩增子 的存在，同时当它保持橙色说明没有扩增通过2%琼脂糖凝胶上该扩增子电泳分析，用于 结果确实认有报道称，通过在LAMP之前加入染料叠氮漠化丙锭(PMA),利用PMA染 料结合死菌，抑制扩增的特性区别活菌和死菌该技术简单快速、携带方便、试剂本钱经济 实惠、对生物平安等级和基础设施的要求低但LAMP的缺点也明显，如高温、高湿度、 试剂体积缺乏和样品间交叉污染会导致假阳性率升高LAMP检测至今未有统一的标准化操 作流程，这在一定程度上限制了 LAMP检测方法的推广。

然而，LAMP技术作为一种新的 高效、快速检测手段，对结核病的诊断和防治有着及其重要的意义，因此，标准化的LAMP 检测方法也将会被快速建立并广泛使用2.RNA 恒温扩增实时检测(simultaneous amplification and testing, SAT) 是将新一 代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测相结合的一种新型检测技术，以16SrRNA序列内结 核分枝杆菌菌株特异性核酸片段为扩增靶标，在恒温条件下，利用荧光标记的探针与扩增产 物杂交，实时监测扩增过程进行菌种鉴定RNA恒温扩增实时检测技术是一种新的核酸扩 增技术，引领了新一代的核酸扩增检测技术这一创新技术也可在临床检验、疾病防控和食 品平安检测等各个领域得到广泛的推广及应用其技术原理为：在同一温度(42℃)情况下， 首先通过M-MLV反转录酶与一条引物的相互作用下,先合成一条与模板互补的DNA单链； 然后互补DNA单链自身成环形成一个钥匙状结构，并在M-MLV酶的作用下形成T7RNA 聚合酶启动子的识别区域，T7RNA聚合酶识别转录出多个RNA拷贝每一个RNA拷贝再 从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合, 产生荧光可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。

取液化好的1ml痰标本于 EP管中，以13 000r/min离心5分钟，后弃上清，再加入1ml PBS缓冲液重悬离心，弃上清 将痰液标本加入50 P1裂解液重悬，该样品即为待测样本，用超声破碎仪破碎15分钟，功 率300W后将2 Hl处理物加入含30 U1扩增检测液的洁净微量反响管或者反响板中置恒 温荧光检测仪上进行检测RNA恒温扩增实时检测法既有操作简便，反响速度快，污染率 低的特点，可判断菌株活性，同时还具有灵敏度和特异度高的优点但因为RNA易降解, 对标本要求高，也需要有专职技术人员实施，所以尚未在临床中广泛应用五、高分辨率熔解曲线技术高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)技术建立在核酸分子的物理性质不 同的基础上每个核酸分子的GC含量、分布、核酸长度都是不同的，通过实时监测升温过 程中的饱和染料与PCR产物的结合情况，仪器通过收集这些信息进入分析软件，形成各自 的熔解曲线HRM是一种基于核酸的物理性质，使用饱和染料反映核酸的熔解曲线变化来 进行分析的技术，其不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描, 也可以对突变进行分析。

野生型菌株的峰图与阳性对照Tm值一致，而峰高的不同是由 于被检样本中的模板浓度不同导致仪器探测到的荧光量不同导致；阴性对照呈波谷状，未检 测到荧光；突变株的峰图曲线与野生型、阳性对照的峰形明显不同，主要区别为Tm值明显 低于后者，这是因为发生突变的DNA双链间由于突变造成的碱基不吻合导致双链结合能量 低于正常水平，使DNA解链温度偏低，即探针在较正常偏低的温度时与DNA单链别离并 释放出荧光并被仪器检测至，形成了与野生型菌株不同的曲线根据耐药MTB常见的基因 突变类型，设计不同的反响条件和HRM探针目前已在异烟肺（抬心、泊基因）、利福 平（小3基因）、乙胺丁醇1根3基因）、链霉素（〃“基因）、叱嗪酰胺（p〃cA基因）、 氟喳诺酮类药物（gyM基因）中得到验证HRM技术是一个简单的闭孔系统，被污染的可 能性很小，同时具有高通量、高灵敏度、高特异性，快速、操作简单、重复性好、本钱低廉、 使用范围和检测范围广等优点HRM作为近年来兴起的一项新的分子生物学技术，也存在 其局限性：结核耐药相关基因和相关位点局限，应扩大范围，提高敏感性和特异性六、二代测序技术二代测序（next generation sequencing, NGS）是基于PCR和基因芯片开展而来的DNA 测序技术。

该技术作为新兴的实验室检查手段已被报道用于诸多病原体的诊断，可以对DNA 或RNA样本的碱基对进行快速测序结核送检标本符合NGS检测要求，具体要求为：血 液标本不少于1mL脑脊液、胸腔积液、腹腔积液、心包积液、痰标本、支气管肺泡灌洗液、 鼻咽分泌物、脓液不少于0.5 mlo测序所得病原序列和病原数据库进行比对得到最终结果 以检测到结核分枝杆菌复合群唯一匹配序列为阳性，未检测到唯一匹配序列为阴性NGS 实际上是一种适用于对己知短序列的实时DNA测序分析技术，其重复性、精确性高，具有 高通量、操作简单、检测速度快等优点不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部 位与性质，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的“金标准”和评价其他方法 的参考方法DNA序列测定有多种方法但PCR-DNA序列测定简便、快速，是最常用的 测定方法，已在结核分枝杆菌耐药基因研究中，得到广泛应用随着DNA测序技术的自动 化、规模化、商品化，以及本钱的降低，为今后分枝杆菌基因序列的信息研究以及分枝杆菌菌种鉴定提供了便利条件七、全基因组测序随着技术的开展及本钱的降低,全基因组测序已经广泛应用于结核分枝杆菌的各方面研 究当中，包括微进化与传播、宏观进化与种系发生、耐药检测等。

全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）技术被认为是结核分枝杆菌DNA和耐药检测的终极分子诊断法为保 证阳性率，WGS样本总体要求：纯培养物（固体培养或液体培养）、灭活处理1 .菌体量（1）固体培养：用接种环从别离培养好的L-J固体培养基上刮下绿豆颗粒大小的菌体， 然后将菌体置于1.5ml无菌EP管或2ml无菌螺纹管（管中预先加入500 u 1的TE buffer）o（2）液体培养：2ml浊度1麦氏的菌悬液2 .灭活 寄送前，结核分枝杆菌需灭活灭活流程：80℃水浴，30分钟目前WGS技术日益成熟，在耐药诊断的研究中，全基因组测序能够快速、全面、一次 性获得临床菌株对现有全部抗结核药物的耐药信息，以指导临床医生的治疗方案，从样本采 集到接受治疗仅需要1〜3天的时间但结核分枝杆菌的耐药机制非常复杂，WGS技术对异 烟脱和利福平耐药明确与表型一致的相关突变表现出好的灵敏度和特异度，然而，对其余的 一线和二线药物，WGS准确度存在显著差异八、基因芯片技术基因芯片技术又称DNA芯片技术，是近年开展起来的进行大规模遗传多态性检测的新 方法，是目前分子生物学最前沿的方法。

原理是将多种探针分子固定于支持物上，与标记样 品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度,获取样品分子的数量和序列信息具体方法：①痰液化处理：将痰标本用4%的氢氧化钠溶液，液化好的上清液用于核酸 提取②核酸提取：煮沸法提取核酸核酸进行PCR扩增，产物用杂交缓冲液处理后在芯 片杂交仪上进行杂交，再用芯片洗干仪进行洗涤和甩干，最后用芯片判别系统进行扫描和 结果判读，并详细记录判读结果和芯片信息该法基于核酸杂交的技术，同时将大量探针固 定于支持物上，所以一次可以对样品大量序列进行检测和分析，它有技术操作简单、自动化 程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广等特点但基因芯片的制备比拟复杂，本钱 较高，仪器设备也较贵，不适用于临床标本的检测目前，基因芯片技术已在结核分枝杆菌 的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定及基因组比拟分析研究中得以应用，其中尤以耐药性测 定最为引人关注第三节结核病的免疫学诊断结核分枝杆菌的免疫检测主要包括皮肤菌素试验、结核抗体的检测、结核抗原的检测、 细胞因子的检测等一、结核菌素皮试试验结核菌素皮试试验（TB skin test, TST）也称为Mantoux试验，基于IV型变态反响（见 变态反响）原理的一种皮肤试验，用来检测机体有无感染过结核杆菌。

凡感染过结核杆菌的 机体，会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力当再次遇到少量的结核杆 菌或结核菌素时，致敏T淋巴细胞受相同抗原再次刺激会释放出多种可溶性淋巴因子，导 致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚，导致浸润在48〜72小时内，。