inhibitorandmimics转染使用说明方法学.doc

mmu-miR-125a-5p 研究策略Standard 报价 Standard 报价micrON™ mmu-miR-125a-5p mimic2ng 350 RMB 5ng 600 RMBmicrOFF™ mmu-miR-125a-5p inhibitor,2ng 300 RMB 5ng 500 RMB 转染 mmu-miR-125a-5p mimic(24 孔板为例)1．联系锐博公司合成 mmu-miR-125a-5p mimic 和 mmu-miR-125a-5p inhibitor;2．合成的 2ng mmu-miR-125a-5p mimic 用 1000ul RNase-free water 配制成20uM 的储存液,分装成 5ul 每管放-30 或-80 冻箱冻存(mimic 的工作浓度为50nM);3．转染前一天，胰酶消化细胞并计数 1X105 c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为 90%细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4．对于每孔细胞，使用 50μl无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5． 对于每孔细胞，使用 50μl OPTI-MEMⅠ无血清培养基稀释 1μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。

Lipofectamine 2000 稀释后室温 5 分钟（在 30 分钟内同稀释的 RNA 混合室温时间过长会降低活性 注意：即使Lipofectamine 2000 使用 OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用 D-MEM 培养 如果 D-MEM 做为 Lipofectamine 2000 的稀释液，必须在 5 分钟内同稀释的 DNA混合6．混合稀释的 RNA（第 4 步）和稀释的 Lipofectamine 2000（第 5 步）在室温保温 20 分钟 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染复合物可以在室温保持 6 小时稳定7．直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入 500ul 培养基,混匀注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基8．在 37℃， 5％的 CO2 中保温 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性9．在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性这依赖于细胞类型和启动子活性。

对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素进行稳定表达需要数天或数周. 实验优化:1　miRNA 产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究的目的而异,锐博推荐的 miRNA mimic 初始浓度为 50nM,miRNA inhibitor 的浓度为 100nM,可以根据实验具体的情况优化转染的浓度,优化的范围为 10-200nM2　注:miRNA inhibitor 往往需要用到较大的量才能观察到较好的抑制效果,相当于 miRNA mimic 的几倍用量,这可能与 miRNA inhibitor 抑制的作用机制及作用效率有关.因此,当使用推荐的转染浓度没有获得预期的效果时,可适当选择更高的浓度.。