土壤磷酸酶测定方法.doc

4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)： 1、试剂配制 （1）甲苯 （2）磷酸笨二钠：称取 6.75g 磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至 1L（1 毫升含 25mg 酚） （3）缓冲液 （4）pＨ9.0 硼酸盐缓冲液： 硼酸盐缓冲液（pH9.0） A：0.05M 硼砂溶液：19.07g 硼砂（Na2B4O710H2O）溶于 1000mL 蒸馏水中 B：0.2M 硼酸溶液：12.37g 硼酸（H3BO3）溶于 1000mL 蒸馏水中 硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB 混匀即得缓冲溶液配制： (1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0) A：0.2M 醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于 1000mL 蒸馏水中，或是 27.2g 三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于 1000mL 水中 B：0.2M 醋酸溶液：11.55mL 醋酸定容于 1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB 混合即得 （2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0） 硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）： A：硼砂液：19.072g 硼砂溶于 1000mL 蒸馏水中 B：氢氧化钠溶液：4g 氢氧化钠溶于 1000mL 蒸馏水中 50mLA＋43mLB 加水稀释至 200mL，混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液 （pH7.0） A：0.1M 柠檬酸溶液：21.01g 柠檬酸. H2O（或是 19.21gC6H8O7）溶于 1000mL 蒸馏水中 B：0.2M 磷酸氢二钠：35.61g 磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g 磷酸氢二钠.7 H2O 或是 71.7g 磷 酸氢二钠.12 H2O）溶于 1000mL 蒸馏水中 柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB 混匀即得 （5）2.5％铁氰化钾 （6）0.5％的 4－氨基安替吡啉溶液 （7）酚原液：2 克酚溶液蒸馏水定容致 1 升（2mg/mL） ，溶液在暗色中稳定。

（8）酚工作液：取 2.5mL 原液稀释至 100mL（0.05mg 酚/mL） 2、操作步骤：称取 5ｇ土于 50mL 容量瓶中，加 1mL 甲苯，加塞塞紧轻摇 15min再加入 5mL 磷酸苯 二钠（6.75g 溶于 1L 水）和 5mL 相应的缓冲液(酸性磷酸 酶用 pＨ5.0 大醋酸缓冲液，中 性磷酸酶用 pH7.0 的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用 pH10 的硼酸缓冲液)，同时对每一土样 都设置用 5mL 水代替基质的对 照仔细摇匀后放入恒温箱,在 37℃下培养 24ｈ 用热至 38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过 滤取 1mL 滤液于 100mL 容量瓶中，加 5mL pＨ9.0 硼酸盐缓冲液，再加入 3mL 2.5％的 铁氰化钾和 3mL 0.5％的 4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然 后加水定容待颜色稳定时（20-30min） ，在波长 570nm 处测定各样品的 消光值土壤的 磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量 磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用 P 的毫克数表示，结果需乘 0.32；若用 P2O5 的毫克数表示，需乘 2.29） 。

标准曲线：分别向 100mL 容量瓶中注入 1，3， 5，7，9，11mL 工作液并显色定容（分别 相当于 0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg 酚） ，待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。