红细胞凝集试验.docx

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引 起足够重视但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫 次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力因而通过对鸡群 进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重 要通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象因 此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重 要工作下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明一、 实验用设备：1、 离心机1台* （3000转离心红细胞）2、 冰箱1台*（存放抗原）3、 振荡器1台* （振荡96孔V型板）4、 抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（Al）抗原，从正规厂家进5、 96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、 八道移液器1把（5-50微升稀释血清）7、 吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、 积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、 一次性采血管采血用10、 2毫升注射器采血用11、 红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、 柠檬酸三钠配制3.8%抗凝剂用13、 重铬酸钾配制清洁液用14、 硫酸配制清洁液用15、 吸管1毫升、10毫升16、 吸耳球和吸管配套使用17、 针头9*13 （采雏鸡）、9*25 （采大鸡）18、 蒸馏水当地买清洗96孔V型板、吸头用19、 10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、 生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、 实验前的准备：1. 抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原2•抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用3.1 %红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血=1： 2的比例）， 迅速混匀在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀 的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水 混匀，如此反复离心4〜5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥放入4°C冰箱中可保存2—3天使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液 现用现配4•被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。

5•吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅 拌，操作时必须戴手套，口罩6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，水1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶 解于水中，然后慢慢加入硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾水溶液倒入硫酸中，以防爆炸，操作 时必须戴手套，口罩7•血清稀释液：为灭菌的生理盐水三、实验过程：原理：某些病毒（如新城疫、减蛋、流感）能够与鸡红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象这种红细 胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验（HI）应用：1、检测血清中的抗体水平，确定免疫时机2、免疫后及时监测，确认免疫效果3、辅助诊断病 毒性疾病包括血凝（HA）试验、抗原校正和血凝抑制（HI）试验三步：（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价1、 首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升2、 用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比 稀释到第11孑L,弃去25微升3、 微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。

4、 置于微量振荡器上振荡1分钟5、 室温静置30分钟后观察结果6、 结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红 细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明 红细胞被病毒所凝集能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价 即沉淀的前一孔即为该抗原的效价如彩图1所示第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1： 256图1抗原效价为1： 256（二） 4单位抗原校正：1、 根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原例:上图1 ：抗原效价为1：256 ,HI试验时,25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位,则应将抗原作256/4=64倍稀释即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水2、 首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升第一孔不加3、 用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升4、 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。

5、 于微量振荡器上振荡1分钟6、 室温静置30分钟后观察结果7、 结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立如彩图2所示图2前三孔为红细胞完全凝集，第四孔为红细胞50 %凝集，第五孔为红细胞完全沉淀，说明该次抗原校正成立（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清步骤如下：1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中2•用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孑L,弃去25微升最后一孔 不稀释，为红细胞对照3•用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升4•置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀5•室温静置20分钟6•用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升7•置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀8•室温静置40分钟后观察结果四、结果判定：1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示见彩图3：图3上图抗体结果从上至下依次为：8/7/8/9/8/7/7/62） 判定标准：1•新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上2. H5抗体：抗体值在6以上。

3. H9抗体：抗体值在7以上注：低于以上标准，则需要进行免疫3） 免疫后抗体规律一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月灭活疫苗免后10-15天产生抗 体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月五、实验后的用具处理：1、 96孔V型反应板的清洗：新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物,然后泡在清洁液中， 24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤 干备用属塑料制品，70°C以下烤干2、 微量滴头的清洗：新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时， 捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用 属塑料制品，70C以下烤干3、吸管及积液槽的清洗：将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干, 吸管放入高温干燥箱中160°C干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干积液槽放入恒温箱中烘干。