地贫基因诊断操作规程.doc

α-地贫基因诊断 采用mPCR技术检测三种缺失型α-地贫：左侧缺失-α4.2 缺失, 右侧缺失-α3.7缺失,东南亚型缺失—SEA 反应体系：取出PCR反应管，管内装有21微升PCR反应液，在 管壁上做好标记，并于5000rpm离心2s,而后分别加入已提取的待 测样品基因组DNA1-4微升（含基因组DNA25-100ng）,如DNA不足4 微升，可加入无菌纯水至总反应体积25为微升反应条件：96℃ 15min98℃ 45s64℃ 1min30s72℃ 3min72℃ 5min电泳检测：取5-10微升扩增产物加入2微升6*溴酚兰上样缓冲 液，经1.2%琼脂糖凝胶电泳60-90分钟，后于紫外仪上观察，长度 为1800bp的条带是α-珠蛋白正常基因的代谢产物；长度为 2000bp、1600bp、1300bp的条带分别是α珠蛋白基因-α3.7缺失型、 -α4.2缺失型、--SEA缺失型的扩增产物ß-地贫基因诊断采用反向点杂交技术（RDB）检测17个位点，18种突变反应体系：取出PCR-Mix反应管，在管壁上做好标记，并于 5000rpm离心2s，而后分别加入已提取的待测样品基因组DNA2微升 （含基因组DNA50-100ng）,此时反应总体积为25微升。

按以下条 件进行扩增：50℃ 15min95℃ 10min94℃ 1min55℃ 30s72℃ 30s72℃ 5min35 cycles35 cycles杂交：取15毫升塑料离心管，放入标有患者编号的膜条（应 在膜条的一角用铅笔标记） ，加入A液5-6毫升及所有（25微升） PCR产物，再将离心管稍拧松，以免加热时管盖爆开将离心管放 入沸水浴中加热10min（确保杂交液液面完全位于沸水浴液之下） ， 取出拧紧盖子，放入杂交箱42℃杂交1.5小时，但不超过4小时 取50毫升塑料管，加入40毫升B液于杂交箱或水浴箱中进行预 热至42℃ 洗膜：取出膜条，移至装有预热B液的50毫升管中，于42℃轻 摇洗涤15min（每管40毫升溶液，最多可同时洗4张膜条） 显色：用A液配制1：2000的POD溶液（单做两张膜只需4微升 POD母液，配制成8毫升使用液；做4张膜可用6微升POD母液，配制 成12毫升使用液） ，室温轻摇浸泡30min，弃去POD溶液用A液室 温轻摇洗2次，每次5min用C液室温洗膜1-2min，同时配制显色 液（显色液需新鲜配制） 将膜条浸泡于显色液中避光显色5- 20min观察结果。

附：A、B、C液和显色液配制 A液（2*SSC，0.1%SDS，PH7.4） B液 (0.5*SSC,0.1%SDS,PH7.4) 20*SSC 100 ml 20*SSC 25 ml 10%SDS 10 ml 10%SDS 10 ml 加水定容至1000 ml 加水定容至1000 mlC液 （0.1M柠檬酸钠，PH5.4） 显色液（按顺序加入以下溶液）1M柠檬酸钠 100 ml C液 19 ml加水定容至1000 ml TMB 1 ml3%H2O2 10 μl。