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GHR在宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达及意义任娟，卫 兵，宋恩学，王文艳， 马玉着摘 要 目的: 探讨生长激素受体（GHR)在宫腔粘连（IUA）患者子宫内膜组织中的表达及意义方法: 通过免疫组化半定量和实时荧光定量PCR（QPCR）两种实验方法分别检测IUA组（研究组）和非IUA组（对照组）患者子宫内膜组织中GHR蛋白和mRNA的表达情况结果：免疫组化实验方法GHR蛋白表达：研究组1.70±0.57, 对照组2.77±0.75, P =0.00；QPCR实验方法 GHRmRNA表达：研究组0.64±0.21，对照组1.00±0.33，P=0.03，两组比较差异有统计学意义免疫组化实验方法:子宫内膜腺体与子宫内膜间质GHR蛋白表达χ2=6.053，P=0.025，两部位GHR蛋白比较差异有统计学意义结论：IUA患者子宫内膜组织中GHR的表达低于非IUA者，而且这种表达在子宫内膜腺体中较多，在子宫内膜间质中较少，为IUA患者临床使用生长激素提供一定的理论参考关键词】 宫腔粘连 生长激素受体 生长激素Expression and significance of Growth hormone receptor in theendometrial tissue of intrauterine adhesion patientsRen Juan, Wei Bing, Song Enxue, et al(Dept of Gynecology and Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601)Abstract Objective To investigate the growth hormone receptor (GHR) expression and significance of endometrial tissue in patients with intrauterine adhesions . Methods Semi-quantitative immunohistochemistry and real-time quantitative PCR (QPCR) were used to detect the expression of GHR protein and mRNA IUA in patients endometrial tissue of IUA group (study group) and non IUA group (control group) . Results The immunohistochemical expression of GHR experimental methods: The study group 1.70 ± 0.57, control group 2.77 ± 0.75, P = 0.00; QPCR experimental methods GHRmRNA expression: The study group 0.64 ± 0.21, control group 1.00 ± 0.33, P = 0.03, two group differences were statistically significant. Immunohistochemistry methods: endometrial glands and endometrial stromal GHR protein expression χ2 =5.883, P = 0.025, two parts of the GHR protein expression difference was statistically significant. Conclusion The expression of GHR in endometrial tissue in patients with IUA is lower than those of non-IUA, and this expression is more in endometrial glands, less in endometrial stroma ,which provide a theoretical reference for the use of hormone in IUA patients.Key words intrauterine adhesions; growth hormone; growth hormone receptor宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA) 是因为子宫内膜基底层受损导致肌层裸露,创面的炎性趋化因子和胶原蛋白渗出沉积 ,再加上宫腔各壁创面紧密接触,在内膜逐渐修复的过程中形成纤维粘连带，导致宫腔形态和子宫内膜的生理功能难以恢复。

临床主要表现为月经量减少甚至闭经、周期性下腹痛、不孕、反复流产、产后胎盘粘连甚至植入等近年来IUA 患病率也逐年增加, IUA已严重影响着现代女性的生活质量和生育要求［1］IUA的治疗主要包括经宫腔镜宫腔粘连分解术和术后应用雌激素促子宫内膜生长有研究报道，生长激素（Growth hormone，GH）在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中对反应不良性子宫内膜和子宫内膜反应不良性闭经中都有促进子宫内膜发育的作用［2,3］,这些研究均提示GH可能促进子宫内膜的生长部分研究者在此基础上试图加用GH来提高IUA治疗的效果［4］,但目前关于GH研究主要偏于临床，尚缺乏基础研究的证据本研究通过免疫组化和实时荧光定量PCR（Real time quantity-PCR,QPCR）两种实验方法，研究生长激素受体（Growth hormone receptor,GHR）在IUA和非IUA患者子宫内膜组织中的表达情况，为IUA患者临床使用生长激素提供一定的理论参考 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号81100412）作者单位：安徽医科大学第二附属医院妇产科,合肥市 230601作者简介：任 娟，女，硕士研究生；卫 兵，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，,E- mail:weibing1965@ hotmail. com1.材料与方法1.1材料1.1.1研究对象 2013年11月至2014年05月在我院行宫腔镜检查并确诊为IUA患者28名为研究组，年龄20～35岁，平均年龄29. 62 ±2. 52岁；同期因其他原因（子宫纵膈、不孕或节育器嵌顿）行宫腔镜检查确诊为非IUA患者22例为对照组，年龄20～40岁，平均年龄28. 80 ±3. 34岁，并且这些非IUA患者既往都有宫腔操作史。

1.1.2 主要手术设备 宫腔镜及冷光源（ STORZ 公司 德国）；监视器（ SONY 公司日本）；液体膨宫泵（ Aesculap 公司 德国）；腹腔镜（STORZ公司 德国），异物钳（STORZ公司 德国）；荧光定量PCR仪(Thermo公司 美国) ；微孔板迷你离心机 (杭州奥盛仪器有限公司) 等等1.1.3 主要试剂 免疫组化：一抗：兔抗人GHR单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；二抗：即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒（鼠/ 兔）（福州迈新生物技术开发有限公司）；Trizol 和引物（美国Invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo公司）; QuantiFast SyBr Green PCR kit（德国Qiagen公司）；核酸染料（上海赛百盛公司）1.1.4 术前准备 所有患者空腹状态上午9 时以前抽取静脉血检查生长激素均未见异常，闭经者手术时间不受限制，月经减少者在卵泡期手术1.1.5标本采集 研究组: 患者均行宫腔镜检查确诊为IUA，在检查中或宫腔镜下宫腔粘连分离术操作过程中，视需要在尚残存的正常子宫内膜组织中,用异物钳钳取适量（质量约10mg）的内膜组织作为标本。

对照组:患者因其他原因行宫腔镜检查确认为非IUA且既往有过宫腔操作史,如子宫纵膈、不孕或节育器嵌顿，按需要钳取适量正常子宫内膜组织1.2检测方法1.2.1免疫组化MaxVision两步法 ： ①取存档蜡块，连续切片4um,贴片，65℃温箱烤片2小时，二甲苯脱蜡；②柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，PBS冲洗3次，每次3分钟；③免疫组化染色按MaxVision两步法常规流程进行切片中滴加一抗(兔抗人GHR单克隆抗体以1：400稀释)，4℃过夜，PBS冲洗3次，每次3分钟去除一抗后滴加二抗，试剂盒37℃温箱中孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；④滴加新鲜配制的DAB显色；⑤清水冲洗，苏木精浅染，清水冲洗还蓝，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固以PBS代替一抗作为阴性对照，其余操作流程完全相同1.2.2免疫组化结果判断及半定量分析： 将制好的切片置显微镜下观察，每个样本随机选取5个不重叠400 倍视野进行测量，阳性信号为棕黄色或棕褐色， 根据阳性信号的强弱将结果分为弱、 中、 强三级， 并分别给予 1～3 分： 1分， 无信号或信号很弱； 2 分， 信号中等呈淡黄色或棕黄色； 3 分， 信号很强呈棕褐色。

根据阳性细胞的百分率分别给予1～3 分： 1分， 阳性率 ≤20%； 2 分， 阳性率 21% ～70%； 3 分， 阳性率71% ～100% 上述两项评分相加作为每例的总积分表1免疫组化染色结果判定标准染色程度记分a着色细胞百分率记分b合计得分结果判定（a +b)/2基本不着色1≤20%11-2阴性（-）淡黄或棕黄2>20% ～70%23-4阳性（+）棕褐色3≥70%35-6强阳性（++）1.2.3 QPCR法 ①从子宫内膜组织中提取RNA: 取子宫内膜组织50-100mg经液氮研磨后加入1ml TRIzol裂解；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡；4℃ 12000rpm 离心15分钟，取上清，加入等体积异丙醇沉降；4℃ 12000rpm 离心10分钟，弃上清, 加入1mL 75℅乙醇；4℃ 12000rpm离心5分钟，弃上清， 干燥RNA沉淀；加入20-50 μL DEPC水，55℃促溶10分钟，-80℃保存备用②RNA的浓度及纯度的测定：分别测定OD 260和OD 280以计算RNA样品的浓度和纯度 ③样品cDNA合成:在0.2mL无RNase PCR管中，加入总RNA（质量为2ug）、10μM Oligo（dT）1μL、DEPC水补足至12μL，轻轻混匀、点动离心；PCR仪上65℃加热5min，立即冰浴3min；在0.2mL 无RNase PCR管中加入5×Reaction Buffer 4.0μL、10mM dNTP Mix 2ul、RibolockTM Rnase inhibitor 1μL、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 1μL；42℃ 60min，70℃ 5min，取出上述反应液，即为cDNA，-80℃ 保存备用。

④荧光定量PCR反应（SYBR GREEN方法）：取出上述反应液1ul作为荧光定量的模板，反应体系如下：2×SYBR Green mixture5uL、Forward primer（10uM）和Reverse primer （10uM）各1uL、cDNA1uL、RNase Free water2uL，Total 10uL反应条件：95℃预变性5min，95℃变性10s、60℃退火、延伸30s，共40个循环表2 本实验所用人类基因。