巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展ppt课件.ppt

生科院生科院 杨军杨军Ø宿主系统Ø载体系统Ø转化系统Ø表达系统Ø蛋白修饰与分泌系统 一、前言 二、毕赤酵母简介 三、毕赤酵母表达系统四、毕赤酵母表达系统优化Ø启动子选择Ø外源基因的特性Ø基因剂量ØmRNA的非翻译区Ø翻译后修饰Ø产物的稳定性Ø发酵条件五、前景展望 在过去的数十年中，遗传学家努力于DNA的鉴定和基因重组的研讨，而重组有机体主要运用于蛋白质的消费由于一些蛋白具有宏大的商业价值，因此大多数研讨努力于寻觅可以高效消费有功能蛋白的途径随着蛋白质工程和DNA重组技术的开展，诸多有运用潜力的蛋白分子有待开发， 不同在蛋白在不同系统中表达程度有显著差别，目前运用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等表达体系其中酵母表达系统相对于其他表达系统有以下优点：不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题；并可以对目的蛋白进展类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键构成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工在酵母表达系统中，巴斯德毕赤酵母〔Pichia pastoris,Pp)表达外源基因最理想下面就巴斯德毕赤酵母表达的特点和研讨进展作一简要综述。

 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，可以在低 廉的甲醇培育基中生长，甲醇能高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势由于巴斯德毕赤酵母没有适宜的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列普通整合入受体的染色体DNA上，因此可以稳定遗传目前已有500多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得胜利表达 二、巴斯德毕赤酵母简介Pichia pastoris甲醇代谢途径 目前广泛运用于外源基因表达和研讨的毕赤酵母宿主菌有两种主要类型：营养缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌Ø宿主系统l营养缺陷型： GS115〔his4〕最常用，此菌株的组氨酸脱氢酶基因突变，因此不能合成组氨酸，在不含组氨酸的培育基上不能生长，以此作为挑选标志但由于本身合成蛋白酶对外源蛋白有降解，因此产物存在不均一的问题 其中KM71和SMD1168最常用，KM71〔his4 arg4 aox1 Δ : : SARG〕的AOX1部分缺失，并且被S.cerevisiae的ARG4取代因此AOX1〔强启动子〕基因不能编码醇氧化酶，只能依托AOX2基因〔弱启动子〕编码醇氧化酶，因此KM71为甲醇利用缓慢型〔Muts〕。

l蛋白酶合成缺陷型 SMD1168〔pep4Δ::URA3 his4 ura3〕由于pep4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效减少对外源蛋白的降解但消费缓慢，导致蛋白产量上不去Ø载体系统 由于毕赤酵母没有稳定的游离型载体，故运用整合型载体，经过同源重组整合到酵母染色体来实现稳定表达，整合位点普通是在AOX1或HIS4处，因此，载体上带有HIS4和AOX1基因的部分序列；还包括MCS和大肠杆菌复制所必需的元件，如复制起始位点，氨苄抗性基因；用于分泌表达的载体上还包括有信号肽序列General diagram of a p.pastoris expression vector .YFG,’Your Favorite Gene’; *,sites for cassette amplificationl胞内表达型载体l分泌表达型载体l转化程序 l重组子在酵母细胞中的命运l用于转化子挑选的基因标志 主要有三种方法：原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2% ；离子溶液法:酵母的完好细胞经碱金属离子〔如Li+等〕、PEG、热休克处置后，也可高效吸收质粒DNA。

103~104个转化子/μg DNA；电穿孔法(electroporation) ：酵母菌原生质体和完好细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA105个转化子/μg DNA 导入毕赤酵母的重组质粒能经过同源重组整合到染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：〔1〕同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所交换，胞内醇氧化酶只能来自AOX2基因，酶活性大大降低因此转化子表现为甲醇利用缓慢，表型为Muts 〔2〕特异性的单交换：表达载体在5’AOX1或3’AOX1处线性化后，与染色体基因组中的相应序列发生同源重组，整合入AOX1基因的上游或下游由于AOX1基因未被破坏，仍具有活性，所以转化子能正常利用甲醇，表型为Mut+，在甲醇为独一碳源的培育基中正常生长 通常有5%-10%转化子出现多拷贝整合，可用重组子上标志基因〔如G418〕来挑选多拷贝转化子，斑点杂交来测定外源基因拷贝数普通情况下，整合的外源基因表达单元的拷贝数越多，表达效率越高，可直接经过SDS-PAGE电泳来测定外源蛋白表达量。

此外也可利用同尾酶体外构建多拷贝重组子 假设整合发生在his4位点处，能够出现表达单元丧失景象，这能够是由于基因组中突变的his4与表达单元中的his4基因之间发生了基因转换〔gene conversion〕所致，所以普通选择AOX1位点整合his4l用于转化子挑选的基因标志用于转化子挑选的基因标志 用于毕赤酵母转化子挑选的基因标志主要有营养缺陷型互补基因和显性基因： 营养缺陷型互补基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：HIS4, ARG4〔精氨酸琥珀酸裂合酶〕, URA3 (尿嘧啶合成酶基因〕 显性标志基因，如Zeocin，Blasticidin〔灭瘟素〕,G418l信号肽对分泌表达效率的影响l 毕赤酵母启动子的可控性常用的启动子有诱导型和组成型诱导型启动子包括：PAOX1、PFLD1、PICL1组成型启动子：PGAP〔1〕PAOX1：是由甲醇诱导的强启动子，也是毕赤酵母表达中运用最广泛的启动子，AOX1基因是利用的甲醇的第一个酶基因，它的表达是在转录程度被调控的具有以下优势：以甲醇作为独一碳源时，才干诱导AOX1的表达，因此可严密调控外源蛋白的表达。

可以高效表达外源蛋白缺陷：甲醇添加时间和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量储存危险性大；甲醇为石油化工原料，因此不适宜消费食用蛋白 〔2〕PFLD1：FLD〔Formaldehyde dehydrogenase〕是甲醛脱氢酶基因，是甲醇代谢途径中的另一关键酶，同时参与甲胺代谢FLD1基因既可受甲醇诱导，又可以受甲胺诱导因此它利用甲醇或甲胺诱导PFLD1表达外源蛋白，当用甲胺诱导时，葡萄糖或甘油可替代甲醇做为碳源其严风格控和转录效率与PAOX1相当Resina等发现用甲醇和甲胺共诱导PFLD1与单纯用甲醇诱导相比，外源蛋白Rhizopus oryzae lipase〔稻根霉菌脂肪酶〕的表达量有所提高〔3〕PICL1：柠檬酸裂合酶启动子是一种能以甲醇为独一碳源诱导型启动子，它可以在毕赤酵母中高效表达葡聚糖酶但是，关于它能否在毕赤酵母中启动外源蛋白表达及其诱导表达条件，还需求进一步的研讨 〔4〕PGAP：是一种组成型表达启动子，不需甲醇，操作简单，诱导外源蛋白的表达量与PAOX1相当但不适宜表达对毕赤酵母有毒性作用的蛋白 因毕赤酵母只能识别很少的外源蛋白信号序列,所以更多的是利用酵母的同源信号序列,如来自毕赤酵母的酸性磷酸酶信号序列〔PHO1)和酿酒酵母的α交配因子前导肽〔α-Factor prepropeptide〕，其中α交配因子前导肽运用最广泛。

α-Factor prepropeptide: 来自酿酒酵母，由19个氨基酸残基的前体序列和66个氨基酸的残基的前导肽序列组成，其中前导肽序列中含有三个N-糖基化位点和一个Kex2蛋白内切酶位点，是目前运用最胜利的信号肽信号信号肽构造的改构造的改动能能够会提高分泌效率会提高分泌效率 Antonio等等发现，改造了的信号，改造了的信号肽大大提高了外源蛋白表达大大提高了外源蛋白表达量用经过修修饰的人血的人血洁白蛋白天然信号白蛋白天然信号肽可使可使HSA在在毕赤赤酵母中的分泌提高几倍酵母中的分泌提高几倍 Thomas 等将等将编码10个氨基酸个氨基酸衔接接肽的序列插入到的序列插入到α-Factor与胰与胰岛素前体基因之素前体基因之间，使胰，使胰岛素前体在素前体在毕赤酵母中赤酵母中的表达提高了的表达提高了3倍 作为真核生物，毕赤酵母可以进展类似哺乳动物细胞的蛋白翻译后修饰，如信号肽加工，蛋白折叠，二硫键构成和糖基化修饰等毕赤酵母中外源糖蛋白的糖基化： 酵母菌中的蛋白糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网膜内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。

 糖基分为两种类型：O-糖基和N-糖基O-寡聚多糖只需甘露糖，但许多高等真核生物的蛋白在一样的糖基化位点上都含有唾液酸基团，而且糖基化位点也存在差别N-寡聚多糖核与高等真核生物完全一样，但外侧链却有明显差别而这种差别往往会导致蛋白生物活性下降、免疫原性添加等不良影响  线性化重组载体感受态菌株平板挑选PCR鉴定与挑选MD和MM平板挑选挑选多拷贝外源基因转化子G418表达鉴定与挑选mRNA程度蛋白表达程度高效表达种子工程菌发酵罐工艺建立Muts和Mut+技术道路： 根据启动子的特性选择 甲醇诱导型启动子如PAOX1 ，但甲醇易燃，也不适用于食品消费，这时可选择PGAP,但不宜用于表达对宿主有毒的蛋白强启动子能够产生无功能的蛋白 由于超越宿主本身翻译后修饰加工的才干，引起蛋白的错折叠、不加工或错定位这是可选用较温暖的启动子如PPEX8(一种过氧化物酶体基质蛋白启动子)Ø启动子的选择 目的基因的碱基组成 基因富含A+T，会导致转录提早终止 种属特异性影响 稀有密码子制约翻译速率 此时需求进展全基因的合成，使编码序列符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的G+C含量。

Ø目的基因特性 相对剂量效应 普通情况下，随着整合拷贝数的添加，表达量也会添加，例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上升反而减少，这能够与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关 过高表达对分泌途径抑制 对于分泌蛋白，过高表达会对分泌途径产生负反响抑制 Ø基因剂量 UTR对蛋白表达的影响主要外表在mRNA的翻译程度上， 目的蛋白mRNA5’UTR应尽能够与AOX1mRNA一样 Sreekrishna等经过调整人血洁白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5’UTR一样后表达程度提高50倍以上ØmRNA5’非翻译区 毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链构造的差别而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的运用遭到一定的制约它们在哺乳动物体内可被免疫系统去除而失去效能，而且有引起超敏反响的危险性 处理糖基化战略：尝试胞内表达，防止目的蛋白的糖基化；对非活性中心的糖基化位点进展突变改造，去除糖基化；共表达糖链加工酶，使糖链构造接近哺乳动物，从而降低抗原性。

Ø翻译后修饰l表达产物的稳定性l l 处理外源蛋白降解的三条根本途径：l在培育基中参与富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，添加蛋白酶的底物以减少对目的蛋白的降解；l调理培育基PH值抑制蛋白酶活性；l运用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、 SMD1165等温度：必需温度：必需选择适宜的温度温度升高，反响速率加适宜的温度温度升高，反响速率加大，生大，生长代代谢加快，但温度加快，但温度过高，又会使高，又会使酶酶易因易因热而而失去活性失去活性pH值：：毕赤酵母生赤酵母生长的的pH值范范围比比较宽，因此，因此应中中选择适宜外源蛋白表达的适宜外源蛋白表达的pH值溶氧量：甲醇代溶氧量：甲醇代谢过程中需求耗程中需求耗费大量氧，因此在大量氧，因此在发酵酵过程及程及时补充充毕赤酵母代赤酵母代谢所需求的氧气所需求的氧气对于外源于外源蛋白表达量是至关重要的蛋白表达量是至关重要的甲醇的甲醇的浓度和度和监测：在：在发酵酵过程中，需求定期程中，需求定期补加一加一定量的甲醇以定量的甲醇以补偿甲醇的耗甲醇的耗费和和挥发普通液体培育普通液体培育时，，补加甲醇的加甲醇的终深度到达深度到达0.5%即可。

但即可但详细情况需情况需求根据求根据实验而定，同而定，同时可以根据溶氧和气候色可以根据溶氧和气候色谱控制控制甲醇流加甲醇流加Ø发酵条件 近年来，毕赤酵母表达系统运用的范围越来越广，自20世纪80年代初到如今，人们曾经用毕赤酵母表达体系胜利表达了500多种蛋白，包括疫苗，激素、干扰素、抗菌肽、酶、膜受体蛋白等但毕赤酵母表达系统也存在着一些问题，如蛋白的糖基化程度比哺乳动物偏大，影响蛋白的功能，另外，分泌产物表达不均一，信号肽加工不完全，表达产物降解等，这些都一定程度上限制了毕赤酵母的运用 但随着对发酵工艺的不断完善和对巴斯德毕赤酵母的深化研讨，置信它将会成为表达外源蛋白的有力工具，充分发扬其在生物技术领域尤其是基因工程产品产业化方面的运用潜力。