新城疫病毒分子生物学最新研究进展.doc

新城疫病毒分子生物学最新研究进展秦卓明徐怀英王友令等新城疫(Newcastle disease，ND)又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的鸡和火鸡的急性高接触性传染病，其典型特征为呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、粘膜和浆膜出血，由于该病发病急、致死率高，对养禽业的发展构成严重威胁，被国际兽疫局(OIE)定为A类烈性传染病，中国一类动物疫病长期以来，我国普遍开展了以接种疫苗为主的新城疫综合防制措施，使得ND的暴发得以控制，但近年来，由于家禽饲养规模扩大，NDV疫苗使用混乱，中毒、弱毒、灭活疫苗同时使用，新城疫发病率居高不下，对我国的家禽饲养和对外贸易带来了诸多问题早期对新城疫的研究主要集中于NDV的生物学特性鉴定、致病性比较及疫苗的研制和应用20世纪80年代以来，随着分子生物学技术的发展和完善，对NDV基因组的组成及特性、结构蛋白与功能、致病的分子基础和遗传变异规律等方面的研究不断深入本文将对各国学者在NDV病原学和分子病原学方面所取得的进展作一综述1.新城疫病毒病原学1.1分类地位和形态新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)腮腺炎病毒属(Rubulavirus)。

NDV曾被列为副粘病毒科副粘病毒属的代表种，但由于它兼有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)双重活性，基因组不编码C蛋白等特征，国际病毒分类委员会(ICTV)编写的第六次病毒分类报告将其与腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、禽副粘病毒2-9型(APMV2-9)、猴副流感病毒(SV-5)等单列为一个新属--腮腺炎病毒属整个副粘病毒科分为副粘病毒亚科和肺病毒亚科副粘病毒亚科下设副粘病毒属、麻疹病毒属和腮腺炎病毒属(陆承平，1996)NDV颗粒呈多边性，直径约为100~250nm，有囊膜的病毒粒子一般呈圆形，但因囊膜破损而形态不规则，也可见横断面直径100nm左右的不同长度的细丝病毒粒子核心由螺旋状对称直径为17nm的卷曲的核衣壳组成，外面有双层脂质囊膜，病毒囊膜表面覆盖8nm长的纤突(殷震等，1997)，囊膜表面有两种糖蛋白(HN和F)NDV的核酸由单股负链RNA组成，全长15156bp，分子量约为5×106道耳顿，占病毒颗粒总质量的1%左右此外，病毒粒子含有约20%-25%(w/w)的来自宿主细胞的脂质和约6%(w/w)的碳水化合物病毒颗粒在蔗糖中的浮密度为1.18-1.20g/mL(殷震等，1997)。

1.2理化学特性：NDV对理化因素的抵抗力较强一般NDV在4oC经几周，在-20oC经一年，在-70oC经数年仍能保持感染力大多数去污剂能迅速将其灭活，但Na2CO3和NaOH的消毒效果不稳定NDV对酸、碱的耐受力较强，在pH2和pH10条件下可存活数小时1.3生物学特性：1.3.1血凝性(HA)：NDV可凝集所有两栖类、爬行类、禽类及小鼠、豚鼠的红细胞，但凝集牛、山羊、绵羊、猪、马及人O型红细胞的能力则随毒株的不同而异NDV凝集红细胞是由于其囊膜表面的HN糖蛋白与红细胞表面的受体结合所引起的在现场可用鸡的红细胞做HA试验，并结合抗血清的特异性抑制作用(HI试验)来诊断ND的发生和监测免疫状况1.3.2神经氨酸酶活性(NA)：神经氨酸酶活性是HN蛋白的一部分，该酶的明显作用是可将病毒逐渐从红细胞上洗脱下来，Huang等指出该酶还可以作用于受体位点，使F蛋白充分接近细胞而发生病毒与细胞的膜融合1.3.3细胞融合与溶血活性：NDV和其他副粘病毒可因同一机制引起红细胞溶解或细胞融合病毒复制时附着于受体位点，随后引起病毒囊膜与细胞膜的融合，进而导致两个或多个细胞的融合僵硬的红细胞膜常因与病毒之间的膜融合而导致溶解。

同血凝活性一样，细胞融合与溶血活性也可被特异性抗血清所抑制1.3.4其他活性：NDV有诱导干扰素生成的作用最近的研究发现，NDV还有抗肿瘤免疫、引起细胞凋亡的特性，这使得NDV在抗肿瘤发生及衰老机理等方面的研究上很受重视(Karin et al 1994；Jinyang Zeng等，2002)1.4抗原性：传统的检测方法均采用多克隆血清进行抗原分型所有NDV分离株均表现为相同的抗原性，因此认为NDV只有一种血清型但病毒中和试验、琼脂扩散试验和Mcab检测证明不同NDV毒株间存在微小的抗原性差异(Alexander et al，1992)1.5 NDV的基因分型：Ballagi-Pordany等(1996)以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了1932~1989年从世界各地分离的200多株NDV的F基因1349个核苷酸(第334~1682位核苷酸之间)，用Hinf I、Bst I、Rsa I三种限制性内切酶对RT-PCR产物进行分析，可将NDV毒株分成6个基因型(genotype)，第I型包括主要从水禽和一部分鸡分离的缓发型毒株；第II型包括60年代以前从北美分离的缓发型和中发型疫苗株；第III型包括2个早期从远东分离的速发型毒株；第IV型包括第一次ND大流行的毒株(hert 33和italien)以及他们的后代变异株，第V型包括70年代早期从进口鹦鹉和感染鸡群中分离的速发型毒株；第VI型包括60年代后期从远东分离的毒株以及随后从亚洲和欧洲分离的速发型毒株。

Yang等(1999)通过对45株NDV的F基因推导氨基酸序列的同源性比较后发现，第1次ND(1926~1960)流行是由基因II~VI型引起的；第2次(1960~1973)流行是由基因V~VI型引起的；第3次(70年代末后)流行是由基因VI型引起的；目前欧洲ND的流行及台湾地区1984年以来ND的流行是由于基因VII型所致第VII型病毒已引起了东亚和西欧多次ND暴发，是正在发生的第4次ND大流行的起源严维巍等(2000)首次报道了基因VII型NDV在中国大陆的存在刘华雷等(2001年)对1994年以来选取的国内不同地区的代表株进行遗传分析证实，所分离的毒株在分裂位点的氨基酸顺序均相当于NDV的强毒株，通过遗传进化树分析表明：8株分离株中有7株为基因型VII型新城疫病毒曹殿军等(2001)根据NDV F基因编码区1~374位核苷酸序列计算其遗传距离，并绘制了NDV的系统发育进化树，将68株NDV分为9个基因型(30株为国内分离株)，其中I~VI是早已存在的基因型；VII、VIII、IX为新发现的基因型，特别是基因型IX为我国特有的基因型(以F48E9为代表)基因VII型病毒是90年代以来引起新城疫发生的主要病原。

根据遗传距离和分离年代可将此基因型进一步划分为5个基因亚型，分别为VIIa、VIIb、VIIc、VIId和VIIe吴艳涛等(2002)对我国部分地区1985~2000年分离的26株NDV分别进行了研究根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制型内切酶(RE)位点分布，确定了这些毒株的基因型分类地位除2个毒株属于已知的VI b亚型外，其余24株分别属于新发现的基因IX型、VI f亚型、VI g亚型和VII c亚型尹燕博等(2002)通过对国内NDV流行分离株的遗传变异分析表明国内曾经流行和正在流行的NDV共有5个基因型，近几年来正在流行的NDV有4个基因型其中30株分离株为VII型，是主要的流行株；有3株分离株为VI型；有7株分离株为II型；有1株分离株为III型杨润德等(2003)从河北省分离到一株新城疫病毒(HBG-1)，经对其F基因序列分析比较研究后，证明该流行株为新城疫强毒株，有基因VII型的结构特征1.6 NDV的复制：病毒的HN蛋白通过识别吸附于细胞表面的受体来参与病毒粒子的感染；而F蛋白则通过释放融和多肽，穿入细胞膜而发挥致病作用在感染过程中，病毒每个蛋白基因均有相应的mRNA。

此后，负链RNA一方面转录成mRNA，合成相应的病毒蛋白成分，另一方面，转录成其互补链，再合成病毒RNA参与病毒的包装病毒核衣壳的装配发生在胞浆内，在向细胞表面运输过程中，蛋白被糖基化，到达细胞膜表面时形成病毒囊膜，以某种方式从细胞膜表面出芽，形成完整的病毒粒子1.7病毒培养：DNV易在10-12日龄鸡胚的绒毛尿囊膜上或尿囊腔中生长，强毒株常在30-72h内致死鸡胚，呈全身性出血性病变和脑炎尿囊液和羊水含毒量最高且具有血凝活性鹌鹑胚对本病毒更易感，但病毒滴度没有鸡胚高大多数病毒能在继代和传代细胞中增殖，最常用的为鸡胚成纤维细胞、鸡胚肾和乳仓鼠肾细胞细胞感染病毒的典型病变是形成合胞体，并在胞浆内形成不规则的嗜酸性包涵体1.8病原性及生态学：NDV各毒株对不同宿主致病力变化不大，鸡最敏感，鸽子也能感染发病，鸭和鹅被感染但不表现临床症状人也可感染，引起急性结膜炎，偶尔也可侵害角膜NDV甚至能在爬行动物和鲨鱼体内存活一定时间自然条件下，NDV主要通过呼吸道、眼结膜及消化道侵入宿主，本病传播主要通过直接接触病禽或间接摄入被病禽呼吸道分泌物和粪便等污染的垫料、饲料或饮水温和型ND病鸡可长期不断排毒，成为持久性污染源。

2.NDV的分子生物学特性2.1 NDV基因组组成NDV病毒含有一条单股负链RNA基因组，全长15156个核苷酸，分子量约为5×106道尔顿NDV RNA不具有传染性，也未发现有遗传重组基因组本身不能作为mRNA，不带译制病毒蛋白质的信息，因此必须以自己为模板转录一股互补链作为mRNA它包括六个结构基因，编码6种结构蛋白，基因编码区长度分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)1467bp、磷酸化蛋白(Phosphate protein，P)1185bp、基质蛋白(Matrix Protein，M)1092bp、融合蛋白(Fusion protein，F)1659bp、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Haemagglutinin Neuraminidase protein，HN)1713bp、(或1731bp，HN01848bp)和RNA依赖性RNA聚合酶(Large protein，L)6700bp基因的排列顺序为3'-NP-P-M-F-HN-L-5'(Chambers et al，1986)病毒感染细胞后，基因组产生三组RNA，沉降系数分别为18S，22S和35S35S RNA为单一的RNA片断，编码L蛋白。

18S RNA含有编码NP、P、M、F、HN蛋白的5种mRNANorthern杂交证明，18S和35S mRNA包含了所有的编码区域，而22S包含了18S mRNA的编码区域，表明它可能是18S的共价连接产物22S mRNA不含特异片断，但转录产物与18S相似，代表多顺反子信息病毒基因组有98.8%被转录成上述六种蛋白的mRNA，与其它副粘病毒一样，NDV的单股基因组含有一个位于3'端的启动子，除L蛋白mRNA起始信号为3'-UGGCCAUCCU-5'外，其它5种mRNA之间均有一个保守的起始信号3'-UGGCCAUCUU-5'，且每一个基因末端含有转录的polyA终止信号序列，即3'-AUUCUUUUUU-5'序列各基因组间有一个3'-GAA保守序列mRNA的起始信号和polyA之间的距离不等，通常在1-47个核苷酸之间(Schaper et al.1998)此外，在HN基因和L基因的起始端还分别有一个41和50个核苷酸的小开放阅读框P基因除编码P蛋白外还编码一个分子约36KD的V蛋白(如图1所示)2.2 NDV结构蛋白分布及功能所有NDV均编码NP、P、M、F、HN和L六种结构蛋白，根据分布可分为两类：一类为内部蛋白，包括NP、P及L蛋白，这三种蛋白共同参与病毒RNA的转录与复制，形成有活性的mRNA；另一类为外部蛋白，包括HN、F和M。

其中HN、F是两种糖基化蛋白，位于囊膜外表面，分别形成大、小纤突，是重要的宿主保护性抗原。