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应用代谢组学技术探究发现炮制引起大黄多成分变化［摘要］利用代谢组学技术，对大黄全成分进行对比 分析，研究生熟大黄各类化学成分的变化应用超高效液相 色谱-四级杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF)联用技术，获 取大黄生品和熟品的色谱和质谱信息，采用多元统计分析技 术对提取的324个特征峰进行比较分析炮制大黄非靶向代 谢组学研究中，发现大黄生品和熟品化学成分明显不同，与 生大黄相比，炮制后有127个成分发生显著变化，其中125 个成分含量降低，2个成分升高该研究鉴定了其中的10个 化合物，另外推测了其他23个成分的结构类型，其中15个 为软质类，8个为蔥醍类，炮制均使它们含量降低炮制大 黄靶向代谢组学研究发现炮制使芦荟大黄素、大黄酸、大黄 素、大黄素甲瞇含量降低炮制显著影响大黄中多种成分的 含量，代谢组学研究能够比较全面地揭示这种变化［关键词］超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱；大 黄；代谢组学；炮制中药大黄是最常用药材之一，中医临床常用炮制品入 药，以熟大黄居多熟大黄为大黄的干燥根及根茎以酒蒸或 酒炖法炮制而成，其泻下力缓，泻火解毒［1］熟大黄炮制 过程本质上为加热过程，炮制后化学成分可能会发生部分成 分的热降解或其他变化，从而导致药性药效的变化。

因此， 生、熟大黄化学成分的变化与功用的相关性研究具有重要的 科学意义目前报道［2-7］均未有从整体角度出发对大黄炮 制前后化学成分进行整体研究本文运用以生、熟大黄样本 整体为分析目标的代谢组学方法，不局限于研究常见的几种 化合物的变化，因为它们未必是大黄生熟异用的物质基础， 而是对炮制前后大黄进行全谱数据分析，从大黄化学成分中 找寻受炮制影响显著的化学成分1材料Agilent 1290 Infinity-6520 Q-TOF LC-MS Systemo 色谱纯甲醇为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，色谱纯 乙月青为Spectrum Chemical Mfg. Corp.产品，色谱纯醋酸为 天津市科密欧化学试剂有限公司产品，水为M订li-Q超纯水生、熟大黄均由成都中医药大学提供，经成都中医药大 学胡昌江教授鉴定为药用大黄Rheum officinale Ba订1.的 干燥根茎，生大黄产地为四川，熟大黄120 C高压蒸制3 h, 每100 g大黄加30 mL黄酒2方法2. 1样品溶液的制备本实验以同一产地不同批次大黄生品和熟品为研究对 象（7个批次），精密称取各个批次生大黄和熟大黄干燥粉末 各1.00 g,每份药材粉末加入50%甲醇10 mL,浸泡16 h后 样品超声提取30 min, 3 000 r • min-1离心5 min,上清液 过 0.22 um 滤膜，待 UHPLC-Q-T0F 分析。

2. 2超高效液相色谱-质谱联用分析条件生、熟大黄全谱分析采用Agilent 1290超高效液相色 谱系统串联6520 Q-TOF-MS实验采用Agilent公司ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱(3.0 mmX 150 mm, 1. 8 u m), 流动相0.1%醋酸(A)-乙睛(B),梯度洗脱，0〜15 min, 5%〜100% B,流速 0. 4mL • min-1,柱温 40 C,进样量 1 uL, 检测波长280 nmo质谱采用ESI离子源，负离子模式下采集 数据，数据采集范围m/z 100〜1 500,温度350 C,干燥 器流速8 L - min-1,雾化气压力275. 86 kPa,毛细管电压 3 500 V, Fragmentor 电压 200 V, skimmer 电压 65 Vo2. 3数据处理获取UHPLC-MS指纹图谱后，采用软件XCMS进行特征峰 提取，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据 矩阵把数据矩阵导入软件MetaboAnalyst2. 0(http： // www. metaboanalyst. ca/MetaboAnalyst/faces/Home・ jsp) 中, 采用主成分分析(PCA)得分图直观的表示炮制前后组间差 异；通过偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)的VIP值筛选 炮制前后变化显著的化学标志物；找到的化学标志物通过 Metlin 代谢组学数据库 (http : //metlin. scripps. edu/index. php) 鉴定。

2. 4化合物的鉴定本实验通过一级质谱确定精确相对分子质量，二级质谱 获得断裂信息，结合Metlin搜索及已报道文献来推测化合 物3结果与讨论3.1数据的获取与处理代谢组学通过比较对照组和实验组的代谢组(metabolomes,某一生物的所有代谢物组分)以寻找代谢 谱的差异代谢组学得到的是大量、多维的信息，为确保质 谱信息的质量，本研究进行了样品提取和质谱分析的优化， 获得了高重复性的数据为降低系统引起的误差，使用了多 样品的等量混合液作为参比溶液，然后每个样品的质谱信息 与该参比溶液的质谱信息进行归一化处理随后，应用一系 列的化学计量学方法对数据进行分析，通过模式识别技术判 断大黄炮制前后的变化，深入分析了炮制后大黄中各成分的 变化趋势，并对炮制后变化显著的化学成分进行鉴定或结构 类型的推测大黄所含化学成分复杂，主要包括蔥醍、软质及其昔类 等多种成分，因此建立一种快速、高通量的分析方法是十分 必要的本研究采用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 (3.0 mmX150 mm, 1. 8 um)色谱柱，乙膳-0. 1%醋酸溶液体系 梯度洗脱，建立了快速的UHPLC同时检测多种类成分，在15 min内实现了对大黄样品的全谱分析（图1）。

对图1进行直观分析，可以看出生大黄和熟大黄在化合 物含量（量）和组成（质）上都有差别，与生大黄相比，熟 大黄的绝大部分主成分含量明显下降因此对其进行多元统 计分析，以更加系统、准确和客观地在大黄中找到受炮制影 响显著的化学成分 UHPLC-MS原始数据不能直接用于后续的数据分析，必须经过峰判别、峰对齐和归一化等前 处理步骤本文采用XCMS软件对样本进行特征峰提取，最 终提取了包含756个特征峰的三维矩阵（峰序列号、样本号、 峰强度），经t检验发现其中有543个特征峰具有统计学意 义（P❷0.05）通过合并当中的同位素峰，最终得到了含有 324个特征峰的三维矩阵用于所有的后续数据分析3. 2炮制大黄代谢组学研究大黄含有，蔥醍、蔥酮、鞍质和多糖等多种化学成分在 炮制大黄化学成分研究方面，普遍认为炮制使大黄中结合蔥 醍和软质减少田国芳和张村等分别研究大黄5种炮制品 （生、酒、醋、熟、炭）中芦荟大黄素-3-CH2-0-B -D-葡萄 糖昔、大黄素-8-0- B -D-葡萄糖昔⑵和芦荟大黄素 -8-0- B -D-葡萄糖昔、大黄酸-8-0- B -D-葡萄糖昔［3］变化 规律发现，熟片、炭片含量较生片下降明显。

郭东艳等［4］ 对大黄不同炮制品中软质含量测定发现炮制后软质含量均 有不同程度的降低目前对大黄炮制后游离恵醍的变化趋势 未取得一致的结论，甚至出现截然相反的结果李先瑞等［5］ 采用酸水解法结合高效液相色谱研究了炮制对大黄5种游离 蔥醍的影响，结果与生大黄相比，熟大黄5种游离蔥醍都有 所下降张村等［6］以HPLC直接测定大黄5种不同饮片中游 离蔥靦进行比较研究，发现与生片比较，5种游离蔥醍在熟 片、炭片中含量明显增加，而醋片、酒片中含量下降李会 芳等［7］研究大黄炮制后主要化学组分的变化规律表明游离 恿醍：熟大黄＞酒大黄〉生大黄＞大黄炭，其中与生大黄相比, 熟大黄的芦荟大黄素、大黄素、大黄酚含量增加，大黄酸、 大黄素甲瞇含量降低；结合蔥醍和软质：生大黄〉酒大黄＞熟 大黄〉大黄炭本文对生、熟大黄进行了非靶向代谢组学和靶向代谢组 学研究非靶向代谢组学研究中，利用主成分分析（PCA） 和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）法进行聚类分析，找 到炮制后变化最显著的一些化合物，并对其进行结构鉴定， 探索大黄炮制的物质变化靶向代谢组学研究中，探讨了炮 制对大黄中既是重要活性成分也是药典中大黄含量测定的 指标成分的大黄5种游离蔥醍的影响。

3. 2.1炮制大黄非靶向代谢组学研究聚类分析表明炮 制引起大黄发生显著变化本研究首先采用PCA这种多变量 模式识别方法［8］对7批次生、熟大黄样本进行降维分析 目的是通过PCA分析，解决生品和炮制品的分类问题结果 表明，PCI, PC2分别为0. 716, 0. 113, PC1和PC2能代表 超过82. 9%的样本信息生、熟大黄的PCA模型显示生熟大 黄2组样品分别分布在不同区域，分类结果理想，说明大黄 炮制前后化学成分存在明显差异（图2A）并且与生大黄相 比，不同批次熟大黄聚集非常紧密，说明炮制对大黄化学成 分影响非常显著随后，进行了基于7批次生、熟大黄样本 的热图分析（图2B）,以把每一个参与分类的特征峰含量变 化以可视的方式展现出来从图中可以看出，与生大黄相比 较，熟大黄绝大部分特征峰含量是降低的，仅有右侧少数特 征峰含量升高图2A用2个主成分对生熟大黄分类，图2B 用324个特征峰强度对生熟大黄分类，2种分类方法中生熟 大黄都有明显的聚类，说明生熟大黄确实存在差异本文采用Pareto Scaling技术处理的PLS-DA法对样本 数据进行处理常用变量载荷评价参数VIP值来描述变量的 贡献程度，一般，当变量VIP大于1可以认为这个变量是重 要的。

PLS-DA的VIP得分图显示，VIP大于1的共有127个 特征峰，125个特征峰含量降低（图2C）,约占98%,炮制后 2个特征峰含量升高，约占2%,说明炮制引起大黄多种化学 成分发生变化，且含量降低的成分占多数本研究通过一级质谱确定精确相对分子质量，二级质谱 获得断裂信息，结合Metlin搜索及已报道文献［9-11］推测 出了 10个炮制后显著变化成分（表1）,大黄炮制后这10个 化学成分含量均显著降低（图3）1号峰准分子离子峰［M-H］-的精确相对分子质量为 331. 068 2 （图4A）,分子式最可能为C13H16010,误差 3. 54X10-6,碎片离子中存在典型的没食子酸碎片峰（m/z 169.013 1, 125. 023 4）,准分子离子峰与碎片峰m/z 169. 013 1相对分子质量相差162,故推测其可能为没食子酸的昔类 衍生物结合已报道文献［9］,判断该化合物为没食子酸 -3-0-葡萄糖昔或没食子酸-4-0-葡萄糖昔同样的方法，另 外7个化合物也被鉴定出来，2〜6号峰被分别鉴定为没食子 酸3-0-（67 -0-没食子酰）葡萄糖昔或没食子酸4-0-（67 -0- 没食子酰）葡萄糖昔、儿茶素葡萄糖昔、原矢车菊素B5、儿 茶素或表儿茶素、莲花掌昔，7号和8号峰分别为1-0-没食 子酰-2-0-桂皮酰-B-D-葡萄糖昔和2-桂皮酰T, 6-二没食 子酰-B-D-葡萄糖昔或6-桂皮酰-1, 2-二没食子酰葡萄糖 昔。

炮制后它们的含量均下降，该项工作与前人对大黄中总 软质类的研究结果一致［4, 7］9号峰准分子离子峰［M-H］-精确相对分子质量为 517. 098 7 （图41）,分子式最可能为C24H22013,误差为 -0. 2X10-6o其碎片离子中存在典型的大黄素（或异构体） 碎片峰（m/z 269. 045 6）,推测其可能为大黄素（或异构体） 的衍生物根据精确相对分子质量、一级二级质谱信息结合 已报道文献［9］,判断化合物为大黄素-8-0- （6‘ -0-丙二酰 基）葡萄糖昔或异构体文献中已报道过大黄素-8-0-葡萄 糖昔的含量下降［2］,但是丙二酰基取代的大黄素-8-0-（6, -0-丙二酰基）葡萄糖昔变化属首次检测到同样的方 法鉴定出10号峰为紫胶酸D-8-0- （6‘ 。