沙门氏菌属诊断血清说明书.doc

沙门氏菌属诊断血清学试验操作程序1. 目的制定沙门氏菌属诊断血清使用程序，指导对沙门氏菌属进行血清学分型2. 原理用沙门氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收出去非特异性凝集素后制成，通过凝集试验原理供沙门氏菌属常见菌型定型3. 试剂及实验设备3.1 沙门氏菌属诊断血清：宁波天润生物药业有限公司生产的规格为11种的沙门氏菌属诊断血清3.2 试剂保存：2~8°C避光保存，防止冻结，在有效期内使用3.3 实验设备：玻片、吸样枪、接种环、水浴箱、玻璃管、血平板、营养琼脂、电热高温接种灭菌器4. 程序步骤4.1 将诊断血清于冰箱取出后平衡至室温4.2 选择经初步生化检测符合沙门菌生物特性的疑似菌落4.3 菌群分析将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，先用O多价A~F群血清进行凝集试验，如阳性，提示待检菌可能属于A~F群范围内，因97%以上的沙门菌都包括在A~F6个O群之内，如果不凝再使用其他O抗血清进行凝集试验，如与其中一种抗血清凝集，待检菌即属于相应的菌群若与多价O抗血清不凝集，有如下3种可能：①含有Vi抗原；②A~FO群之外的沙门菌；③沙门氏菌属以外的细菌可按下述方法进一步检测，将纯菌落用无菌生理盐水洗下，制成浓菌液，再分成2份。

1份不经处理，为活菌液，另1份放100°C水浴中30min，为加热菌液取活菌与Vi抗血清，取加热菌与Vi抗血清凝集，加热菌与Vi抗血清、A~F多价O抗血清分别进行玻片凝集试验根据结果作如下分析：①活菌与Vi抗血清凝集，加热菌与Vi抗血清凝集者，可能属于C群或D群菌，用O7和O9抗血清定群；②活菌与Vi抗血清不凝，可能属于A~FO群之外的沙门菌或其他菌属细菌，需进行生化试验定属，若符合沙门氏菌属细菌特征，可送CDC鉴定；③加热菌与Vi抗血清凝集，而与A~F多价O抗血清不凝集者，可报告为阴性4.4 血清型分析菌群确定后，分析被检菌的鞭毛抗原成分先分析第1相鞭毛抗原，再分析第2相鞭毛抗原第1相鞭毛抗原分析：根据菌群分析结果，分别选用第1相鞭毛因子血清进行玻片凝集试验第2相鞭毛抗原分析：所用抗血清，通常是复合因子（1、2、3、5、6、e、n、I、w）血清单相菌，如第1相已确定，可结合菌群分析及生化反应结果判断血清型如为双相菌，只分析出第1相鞭毛抗原，大多数也可结合菌群分析和生化结果判断血清型，必要时进一步探索第2相鞭毛抗原若只分析出第2相鞭毛抗原，须进一步探索分析第1相抗原探索另1相抗原可按下述方法和步骤进行。

如“小内管”法，一支已融化半固体琼脂，插入一支无菌两端相通小玻璃管于培养基当中，长度稍高出半固体液面待琼脂泠却凝固，用接种环取1~2环待抑制相H抗血清，放入小内管的琼脂表面，然后接种被诱导菌株于小内管含抗血清琼脂层面，35°C孵育4~6h或过夜，取小内管外半固体琼脂层生长培养物，接种于平板或直接做凝集反应，可获得待诱导相的菌株有些种的确定是靠鞭毛抗原中的微小差异来分析的，因而获得丰富鞭毛抗原的培养物十分重要4.5 将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，用生理盐水制备2麦氏单位的菌悬液，取诊断血清20μL于洁净玻片上，然后取20μL待检菌悬液与血清混匀，轻轻摇动玻片，1min内呈现明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性，每次凝集试验均应以生理盐水作为阴性对照试验4.6 根据其生化反应和与O抗血清、Vi抗血清、H抗血清的凝集结果对照沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表，确定沙门菌的菌型4.7 沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原，见附表5. 质量控制O多价A~F群血清选择伤寒沙门菌ATCC14028为阳性对照；大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照附表：沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表O 群血清型抗原式O:2（A）甲型副伤寒（Paratyphi-A）1,2,12:a:-O:4（B）德比（Derby）阿哥纳（Agona）鼠伤寒（Typhimurium）乙型副伤寒（Paratyphi-B）斯坦利（Stanley）圣保罗（Saintpaul）1,4,12:f,g:-1,4,12:f,g,s:-1,4,5,12:i:l,21,4,5,12:b:l,21,4,5,12:d:l,21,4,5,12:e,h:l,2O:7（C1）汤卜逊（Thompson）波茨坦（Potsdam）猪霍乱或丙型副伤寒（Choleraesuis or Paratyphi-C）婴儿（Infantis）6,7:k:l,56,7:l,v:e,n,z1567,(Vi):c:l,56,7:r:l,5O:8（C2）纽波特（Newport）曼哈顿（Manhattan）病牛（Bovismorbificans）科特布斯（Kottbus）6,8:e,h:l,26,8:d:l,56,8:r:l,56,8:e,h:l,5O:9（D1）伤寒（Typhi）爪哇那（Javiana）鸡（Gallinarum）9,12,(Vi):d:-1,9,12:l,z28:1,61,9,12:-:-O:3,10（E1-E2）鸭（Anatum）火鸡（Meleagridis）伦敦（London）纽兰（Newlands）3,10(15):e,h:l,63,10(15)e,h:l,w3,10:l,v:1,63,10:e,h:e,n,xO:1,3,19（E4）山夫登堡（Senftenberg）塔克松尼（Taksony）1,3,19:g,s,t:-1,3,19:i:z6O:11（F）阿伯丁（Aberdeen）11:i:1,2。