细菌内毒素检查技术培训班讲解.ppt

细菌内毒素检查技术 讲 义 北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月 2007-9-101Bitab 目 录 一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3 二、 BET试验前的准备------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术-------------28 1，鲎试剂灵敏度复核-------------------------33 2，干扰初筛试验------------------------------40 3，干扰试验------------------------------------49 4，检查法---------------------------------------62 四、细菌内毒素检测技术的发展 2007-9-102Bitab 一、细菌内毒素检查的基础 理论 1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识 2007-9-103Bitab 1、细菌内毒素 1）化学成分及特性 -- 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 -- 是高分子量脂多糖复合物（LPS） 除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性 致热性 耐热性 酸碱性 与鲎试剂反应 分子极性 需要在250摄氏度干热至少30~60分钟才能彻底灭活 多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性， 在水中呈不均匀分布 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原， 再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应 与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶 与强酸强碱水解反应 （1）特性 2007-9-104Bitab 内毒素的分子结构 （2）化学结构 -- 含有3个截然不同的区域 ◆O- 特异侧链 ◆核心多糖 ◆类脂A 2007-9-105Bitab 2） 内毒素与热原的关系 -- 内毒素是热原之一种 -- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和 最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。

3）标准内毒素和环境内毒素 1）标准内毒素 经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET 检查的参考品或对照品主要分参考标准品（RSE）及工作标 准品（CSE）CSE的效价必须用RSE来标化目前CSE的效价 有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际） 2）环境内毒素 天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成 分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极 性不明显，致热性较标准内毒素弱BET的对象是环境内毒素 2007-9-106Bitab 4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标 准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀 15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟 ，其他国家药典都有类似要求 -- 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 2007-9-107Bitab 2、鲎试剂 1）鲎试剂的分类 -- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） -- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 -- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂 2007-9-108Bitab 2）鲎试剂的规格 -- 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量 试剂） -- 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验 试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次 试验试剂 -- 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应 先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。

2007-9-109Bitab 3）鲎试剂的质量标准 -- 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝 集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml 、 0.06EU/ml、0.03EU/ml -- 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应 -- 缓冲能力 -- 干燥失重 -- 无菌：中国标准无此项要求 2007-9-1010Bitab 4）鲎试剂与内毒素的反应机理 C因子活化的C因子 内毒素 活化的B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白（凝胶） 凝固蛋白原 β葡聚糖或LAL-RM 活化的G因子G因子 二价阳离子 AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA （酶作用物） AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA 405nm测吸光度值 （对硝基苯胺 黄色） 2007-9-1011Bitab 3、BET用水 w2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏 度的鲎试剂在371℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌 注射用水。

w2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于 0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒 素含量应少于0.005EU/ml w美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应 的灭菌注射用水或其他水 2007-9-1012Bitab 4、BET程序 1）验证实验 w凝胶法 w光度测定法 2）检查法 w凝胶法 w光度测定法 动态法 终点法：终点比色法试 验 灵敏度的复核试验 干扰试验 标准曲线可靠性试验 干扰试验 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 动态比浊法试验 动态比色法试验 动态终点法 2007-9-1013Bitab 5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查 法 1）综述部分 w细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 w内毒素标准品及检查用水 wBET器具的要求 w供试品溶液的要求 w内毒素限值的确定 w最大有效稀释倍数的计算 2007-9-1014Bitab 2）试验部分 （1）凝胶法 w鲎试剂灵敏度复核试验 w干扰试验 w检查法 （2）光度测定法 w标准曲线的可靠性试验 w干扰试验 w检查法 3）2005年版药典BET法际验部分主要内容 凝胶限量试验 凝胶半定量试验 2007-9-1015Bitab 鲎 试 验 方 法 凝胶法光度测定法 限量法半定量法动态法终点法 动 态 浊度法 动 态 显色法 终 点 浊度法 终 点 显色法 灵敏度以标示灵敏度表示以标准曲线最低浓度表示 预试验 1灵敏度复核试验 各浓度平行4管, NC 2管 标准曲线验证试验 各浓度平行3管，NC 2管 有效条件①D阴性 ②0.5≤c≤2 ① | |≥0.980 ② TD＞TC（对动态 法而言） 预试验 2干扰试验干扰试验 无干扰条 件 ①A、D阴性 ② 0.5≤Es≤2 0.5Es≤Et≤2Es ① | |≥0.980 ② 50%≤R≤200% ③TD＞TC 检查法A、B、C、D各平行2管(共8管 ) A、B、C、D各平行2管(共12管) 有效条件① B、C阳性 ② D阴性 ① | |≥0.980 ② 50%≤R≤200% ③TD＞TC 2007-9-1016Bitab 1）内毒素限值 （1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公 式确定：L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示 ； K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kgh) 表示，注射剂K=5 EU/(kgh),放射性药品注射剂K=2 EU/(kgh), 鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kgh), M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh)、 mg/(kgh)、 U/(kgh)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂 若不足1小时，按1小时计算。

6、相关参数的计算 2007-9-1017Bitab （2）内毒素限值计算举例 -- 注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次 L= =0.20EU/mg -- 注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0至8.0g，分3至4次 给药，一日最高剂量不超过12g L= =0.075EU/mg -- 对于大输液（LVP）,美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml 5 EU/(kgh) 1500 mg/(60kgh) 5 EU/(kgh) (12000mg/3) / (60kgh) 2007-9-1018Bitab 2）最大有效稀释倍数 -- 供试品最大有效稀释倍数（MVD）按以下公式计算 MVD=CL/λ C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml; 当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位为mg/ml或 U/ml凝胶发 中，λ为鲎试剂的灵敏度 光度测定法中，λ为标准曲线最低浓度 -- 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠（ 浓度为10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为 MVD= =8 (倍) 10mg/ml x 0.2EU/mg 0.25EU/ml 2007-9-1019Bitab 3）最低有效稀释浓度(MVC) -- MVC=λ/ L -- 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠的 最低有效浓度为 MVC= = 1.25mg/ml 4) 样品稀释过程中加液量的计算 -- 稀释过程中，假设从溶液S1取（x）ml溶液稀释（n）倍至S2， 加液量为（y）,则满足： y= (n-1) X x -- 如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为： y=(3.8-1) X 0.5=1.4ml 即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2 0.20EU/mg 0.25EU/ml 2007-9-1020Bitab 7、试验相关知识 1) 内毒素标准品的使用 （1）复溶 w -- 复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时 溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。

w复溶液的体积一般为1ml,或根据使用说明书加液 （2）效价 w-- 厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis,CoA） w效价分析证书应注明：RSE/CSE ____EU/mg; _____ng/瓶 2007-9-1021Bitab 2) 鲎试剂的使用 -- 使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使 用 -- 复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫 -- 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反 应试管的振动造成假阳性 3）内毒素的清除 （1） 冲洗 w适用于器械组件、塞子等 w可用于加热等方法提高清除效率 （2）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态 逸出 （3）反渗透 （4） 超滤 （5）活性炭吸附 2007-9-1022Bitab 4）内毒素的灭活 （1） 酸/碱水解 （2）氧化 -- H2O2 （3）干热 -- 250℃，>30分钟的干烤 2007-9-1023Bitab 二、BET试验前的准备 1. 在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品 或试剂接触的器具必须经过除热原处理。

n玻璃器皿一般用洗液浸泡4小时后，用自来水 冲洗，再用真馏水冲洗、晾干最后在280℃干烤 至少120分钟 2007-9-1024Bitab 2. 试验所试用的器具。