膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析 .doc

1膀胱癌多药耐药的流式细胞术分析 本实验旨在研究流式细胞术(flow cytometry,FCM)在膀胱癌细胞的多药耐药分析方面的作用，现报道如下 一、材料与方法 1.试剂及仪器：DMEM 、DNA 提取试剂盒 DNAzol、RNA提取试剂盒 Trizol 为 Gibco 产品；秋水仙素、甲酰胺、 polybrene为 Sigma 产品；缺口平移系统(nick translation)为 Promega 产品，尼龙膜为 Zeta Probe 产品；鲑鱼精 DNA 购自晶美生物公司；MDR-1 pCR 引物 P1：5′CCCATCATTGCAATAGCAGC-3′,P2:5′-CTTCAAACTTCTGCTCC tGA-3′［1］ ，由军事医学科学院放射医学研究所合成；抗 P-gp 单克隆抗体 JSB1 购自福州迈新公司；FITC 标记羊抗鼠 IgG 购自北京中山生物技术公司；阿霉素由法玛西亚公司福建办事处提供；FCM 检测由北京中医研究院西苑医院流式细胞室完成 22.细胞株：转导人 mdr-1 cDNA 的逆转录病毒包装细胞PA317/PHamdr-1/A 由本室保存［1 ］ 人膀胱癌细胞株 EJ 由北京医科大学泌尿外科研究所提供。

以上细胞均生长于 DMEM 培养基中，其中含体积分数为 10%的胎牛血清和 200 mmol/L 的 L-谷氨酰胺，在体积分数为 5%的 CO2、37℃培养箱中培养逆转录病毒转染 EJ 细胞参照文献［1］进行 3.转 mdr-1 基因细胞系 EJ/MDR 的鉴定： (1)PCR 分析mdr-1 基因的整合：参照 DNAzol dNA 提取说明书提取 EJ/MDR-1 细胞基因组 DNA，取 1 μl DNA 用于 PCR 扩增50μl 体系：200 μmol/L dNTPs、1.5 mmol/L Mg2+，2 种引物各 0.5 μmol/L，95℃预变性 1 min，加 Taq 酶 2 U(Promega 公司) PCR 仪上扩增：94℃变性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，30 个循环后 72℃延伸 7 min，2% 琼脂糖凝胶电泳检测 167 bp特异扩增带2)外源基因在转染细胞的表达分析：mdr-1 基因cDNA 探针用 StuⅠ酶切质粒 PHamdr-1/A 获得，DIG 缺口平移法标记探针，按 Trizol 说明书提取细胞总 RNA，甲醛变性电泳检测RNA 的质量，紫外吸收法定量，按文献［4］进行 RNA dotblot。

34.间接免疫荧光分析：收集对数生长期 EJ/Mdr-1 及 EJ 细胞，PBS 洗涤、离心 2 次调节细胞浓度至 1.0×105 个/ml,加入 P-gp单抗 JSB115 mg/L,4℃放置 30 min；冷 PBS 洗 2 次，加入 FITC标记羊抗鼠 IgG，FCM 检测 P-gp 蛋白表达；参照文献［ 3］行抗体稀释及细胞固定，4℃ 继续放置 30 min；冷 PBS 洗 2 次后送检 5.FCM 测定转基因细胞内阿霉素浓度：参照文献［ 3］进行MTT 法检测 EJ/mdr-1 细胞对化疗药物的体外敏感性：参照文献［4］进行 二、结果 用 PA317/PHamdr-1/A 病毒上清转染的 EJ 细胞，秋水仙素(120 μg/L)加压筛选 3 周，获得抗性克隆，命名为 EJ/mdr-1，培养传代提取 EJ/mdr-1 细胞 DNA 行 PCR 检测，可特异性扩增出167 bp 的 mdr-1 基因片段，而其亲代 EJ 细胞则未扩出此片段，从而证实有 mdr-1 基因的整合提取已转导 mdr-1 基因的 EJ 细胞RNA，Dotblot 结果证实 EJ/mdr-1 细胞中有 mdr-1mRNA 表达。

mdr-1 在 EJ 及 EJ/mdr-1 的阳性表达率分别为 (7.5±2.1)%和4(19.6±4.3)%，差异有显著性 (P＜0.05) EJ/mdr-1 及 EJ 细胞内阿霉素荧光强度分别为 16.85±4.12 和 5.59±3.65，差异有显著性(P＜ 0.05)，MTT 法检测发现，EJ/mdr-1 细胞对阿霉素、秋水仙素的耐药倍数分别是其亲代 EJ 细胞的 7.2 倍和 9.5 倍，差异均有显著性(P ＜ 0.01)nbs p;三、讨论 我们采用逆转录病毒介导将 mdr-1 基因转入人膀胱癌细胞株EJ，经 PCR、Dotblot 检测证明 mdr-1 基因的整合及 mRNA 水平的表达，FCM 结果表明转染细胞的 P-gp 表达也有提高，并最终导致细胞内药物浓度下降，对阿霉素、秋水仙素等亲脂性化疗药物的敏感性降低，说明膀胱癌的多药耐药性与 MDR 基因及其产物的 P-gp 过表达有关 参考文献 ［1］Feng K,Pei xT,Wang LH，et al.Priliminary study ofretroviral mediated transfer of the human mdr-1 gene into 5murine and human hematopoietic stem/progenitor cells.Chin Cancer res,1997,9:268-271.［2］Yang JM,Goldenberg S,Gottesman MM， et al.Characteristics of p388/VMDRC.04,a simple,sensitive model for studying P-Glycoprotein antagonists. cancer Res,1994,54:730-737. ［3］郑国强，韩济生，刘叙仪，等.人胃腺癌阿霉素耐药细胞系 BGC-823/DOX 耐药机理的研究.中华外科杂志，1997，36 ： 325-328. ［4］Stein U,Walther W,Shoemaker RH.Reversal of multidrug by transduction of cytosine genes into human colon carcinoma cells.J National Cancer institute,1996,88:1383-1391. 。