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Western blot 所涉及的Western blot实验在蛋白上样缓冲液中均加有巯基乙醇，上样之前加入终浓度为50 mM的DTT在60ºC处理10分钟 本论文所涉及的Western blot实验所用的SDS-PAGE蛋白胶的浓度均为8% 拟南芥总蛋白提取：拟南芥总蛋白提取： (1) 在1.5 ml EP管中用液氮研磨200 mg植物材料； (2) 加入200 μl提取液后继续研磨直到植物材料重复磨碎； (3) 4 ºC高速（13000rpm）离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (4) 4 ºC高速重复离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (5) 提取好的蛋白溶液可分装到多个EP管，冻于-80 ºC备用 蛋白质浓度的测定（蛋白质浓度的测定（Bradford法）：法）： 材料和方法材料和方法 (1) 分别在两组1.5 ml离心管中各加入0.5 mg/ml BSA（5，10，15和20 μl）， 以0.15 mmol/L NaCl补足至100 μl，同时以两管100 μl的0.15 mmol/L NaCl做空白对照； (2) 每管各加入1 ml考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟； (3) 以波长595 nm测量OD值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

Western blot：： (1) 跑8%的SDS-PAGE电泳，电泳之后取出胶，切去浓缩胶，并在胶的 适当位置做好标记，将胶置于转移buffer中； (2) 剪裁与胶大小相同的滤纸12张，western膜一张； (3) 将膜于甲醇中漂洗15秒后浸于转移buffer中，将滤纸浸于转移buffer； (4) 将6张滤纸对齐放入半干转移槽，用 玻璃棒排去气泡；放上膜，排去气泡；在膜上放上胶，排去气泡；最后再放上6张滤纸，排去气泡在转移夹层的顶部放置顶电极； (5) 接通电流（蛋白质从负极向正极电泳），在恒流下转移蛋白，转膜1-2小时一般电流不超过0.8 mA/cm2； (6) 取出膜，用铅笔做好标记，用双蒸水漂洗1次，然后用TTBS漂洗3次，每次5分钟； (7) 加入封闭液（Blocking buffer），37 ºC摇2小时或4 ºC过夜； (8) 倒掉封闭液，TTBS漂洗3次，每次5分钟加入以Blocking buffer稀释的一抗（一抗的稀释比例依据抗体的效价）37 ºC摇2小时 (9) TTBS洗膜5次，每次5分钟； (10) 加入以Blocking buffer稀释的二抗（1：50000），37 ºC摇1-2小时； (11) TTBS洗膜5次，每次5分钟； (12) 按合适的显色方法显色。

本论文显色采用化学发光显色系统将溶液A和B各200-500 μl（依据膜的大小）混匀，均匀的涂布到膜上，用保鲜膜包好膜，压X光片，依据信号强弱确定曝光时间，取出X光片，显影，定影 拟南芥总蛋白提取及拟南芥总蛋白提取及Western blot相关试剂：相关试剂： 拟南芥总蛋白提取缓冲液（grinding buffer）：50 mM Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，10 mM MgCl2，0.1% NP-40（Nonider P-40），1 mM PMSF 2 X 蛋白上样缓冲液（loading buffer）：2.5 ml 1M Tris（pH6.8），2 ml glycerol，4 ml 10% SDS，500 μl β-mercaptoethanol，500 μl 0.5% bromophenol blue，双蒸水定容至10 ml 30%聚丙烯酰胺溶液：29 g丙烯酰胺和1 g甲叉双丙烯酰胺，溶于60 ml水中，加热至37 ºC溶解，补水至100 ml，滤纸过滤后用棕色瓶贮存于室温 10%过硫酸铵（AP）（W/V）：1 g溶于10 ml水中，4 ºC保存数周可用，尽量现用现配 5X 甘氨酸蛋白电泳缓冲液：15.1 g Tris（0.125 mol/L），72 g 甘氨酸（0.96 mol/L），5 g SDS（0.5%），双蒸水定容至1 L Western转膜缓冲液：2.9 g 甘氨酸，5.8 g Tris，0.37 g SDS， 200 ml甲醇，双蒸水定容至1 L TTBS缓冲液：8.8 g NaCl，20 ml Tris-HCl（1 M , pH8.0），0.5 ml Tween，双蒸水定容至1 L 封闭液（blocking buffer）：5%的脱脂奶粉，以TTBS溶解，现用现配 PMSF母液：0.1742 g PMSF溶于10 ml异丙醇中，母液浓度为0.1 M（应该是取稍多量的固体，加异丙醇，饱和浓度为0.2 M。

这是配制PMSF的标准配方 考马斯亮蓝染色液：1.0 g 考马斯亮蓝R-250，甲醇450 ml甲醇，100 ml冰醋酸，450 ml双蒸水 考马斯亮蓝溶液（用于蛋白质浓度测定）：将100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 ml 95%的乙醇，加入100 ml磷酸，双蒸水定容至1 L，用滤纸过滤后4 ºC保存 脱色液：100 ml甲醇，100 ml冰醋酸，800 ml双蒸水 丽春红S染料溶液：0.5 g丽春红S（Ponceau S）溶解于1 ml冰醋酸，双蒸水定容至100 ml 8%SDS-PAGE（15 ml）分离胶：7.9 ml双蒸水，3 ml 30%聚丙烯酰胺溶液，3.8 ml 1.5M Tris（pH8.8），150 μl 10% SDS，150 μl 10% AP，12 μl TEMED 材料和方法材料和方法 5%浓缩胶（4 ml）：2.7 ml双蒸水，0.67 ml 30%聚丙烯酰胺溶液，0.5 ml 1.0M Tris（pH6.8），40 μl 10% SDS，40 μl 10% AP，4 μl TEMED 1.5M Tris（pH8.8）: Tris (MW121.14) 45.43g 以双蒸水200ml溶解，溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用双蒸水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存 1.0M Tris（pH6.8）：Tris (MW121.14) 30.3g 以双蒸水200ml溶解，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用双蒸水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存 。