高中生物 6.2 DNA片段的扩增 PCR技术课件 中图版选修1.ppt

第二节　第二节　DNA片段的扩增片段的扩增——PCR技术技术课程标准课程标准尝试尝试PCR技术的基本操作和应用技术的基本操作和应用课标解读课标解读1．简述．简述PCR技术的原理和用途技术的原理和用途2．简述．简述PCR技术的基本操作步骤技术的基本操作步骤3．进行．进行DNA片段的片段的PCR扩增(1)解旋解旋在在_______的作用下解开的作用下解开DNA双链2)合成引物合成引物在在____________的作用下，以的作用下，以_________为模板，合成一为模板，合成一段段RNA引物PCR的原理和过程的原理和过程1．．DNA的复制的复制解旋酶解旋酶RNA聚合酶聚合酶DNA单链单链(3)合成子链合成子链以以_________为起点，在为起点，在___________的作用下，以的作用下，以_______________为原料，按照为原料，按照______________原则合成两条新原则合成两条新的的DNA子链1)PCR的定义的定义DNA体外扩增技术实际上是在体外模拟体外扩增技术实际上是在体外模拟___________________过程，形成大量过程，形成大量_________________，这个反应过程，这个反应过程称为称为_______________，简称，简称PCR。

2)PCR与与DNA复制的不同点复制的不同点2．．PCR技术技术RNA引物引物DNA聚合酶聚合酶四种脱四种脱碱基互补配对碱基互补配对细胞内的细胞内的DNA复复特异性的特异性的DNA片段片段聚合酶链式反应聚合酶链式反应氧核苷酸氧核苷酸制制PCRDNA复制复制引物引物人工合成的人工合成的__________或或RNA，其长，其长度通常为度通常为___________________RNA解旋解旋通过对通过对_______________来实现的来实现的解旋酶解旋酶(1)准备：将准备：将PCR缓冲液、缓冲液、_________、、 _________ 、四种、四种脱氧核苷酸、脱氧核苷酸、 ___________ 、、Mg2＋＋等成分加到一个特制等成分加到一个特制的离心管中；的离心管中；(2)高温变性：把离心管置于高温变性：把离心管置于____℃的环境中，使的环境中，使DNA碱碱基对之间的基对之间的_____断裂，形成断裂，形成_____单链，这个过程称为高单链，这个过程称为高温变性；温变性；DNA单链单链20～～30个脱氧核苷酸个脱氧核苷酸反应温度的控制反应温度的控制3. PCR的过程的过程DNA模板模板一对引物一对引物DNA聚合酶聚合酶95氢键氢键两条两条(3)低温复性：再将离心管置于低温复性：再将离心管置于___℃的环境中，使的环境中，使__________分别结合到两条分开的模板链上，这个过程称为低温分别结合到两条分开的模板链上，这个过程称为低温复性；复性；(4)中温延伸：最后将离心管置于中温延伸：最后将离心管置于___ ℃的环境中，在的环境中，在___________的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个一个地连接上去，形成两条新的一个地连接上去，形成两条新的_____，这个过程称为中，这个过程称为中温延伸。

温延伸在在1～～2 h内重复内重复_______次循环，次循环，DNA片段数可增至片段数可增至_________倍4．．PCR的结果的结果55 一对引一对引72DNA子链子链25～～30106～～物物聚合酶聚合酶107 为什么为什么DNA复制必须有引物？复制必须有引物？提示提示　　DNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNA，而只能以，而只能以3′延伸延伸DNA链，故链，故DNA合成时，必须加入引物合成时，必须加入引物(其其3′游离游离)以作为以作为延长延长DNA子链的子链的“引子引子”[思维激活思维激活1](1)PCR原理原理①①PCR原理：原理：DNA分子在一定条件下可以进行半保留复制分子在一定条件下可以进行半保留复制②②DNA的热变性原理：在的热变性原理：在80～～100 ℃的温度范围内，的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性；当温度缓慢下降后，两条被分离的温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链又会重新结合成双链，这个过程称为复性链，这个过程称为复性1．．PCR的原理的原理(2)PCR扩增方向扩增方向①①3′端和端和5′端：为了明确地表示端：为了明确地表示DNA的方向，通常将的方向，通常将DNA的羟基的羟基(—OH)末端称为末端称为3′端，而含磷酸基团的末端称为端，而含磷酸基团的末端称为5′端；一个双链端；一个双链DNA分子中含两个分子中含两个3′端和两个端和两个5′端，如果一端，如果一条链的方向是条链的方向是3′→5′，则另一条链的方向就是，则另一条链的方向就是5′→3′，这就，这就是反向平行的含义。

是反向平行的含义②②DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过3′，，5′磷酸二磷酸二酯键相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中酯键相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子号碳原子上的羟基上的羟基(—OH)，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中，与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成所以原子上的磷酸基团脱水聚合而成所以DNA的合成方向总的合成方向总是从子链的是从子链的5′端向端向3′端延伸(1)PCR的反应条件的反应条件①①稳定的缓冲液环境；稳定的缓冲液环境；②②DNA模板；模板；③③分别与模板分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物；两条模板链相结合的两种引物；④④四种游离的脱氧核苷酸；四种游离的脱氧核苷酸；⑤⑤耐热的耐热的DNA聚合酶，一般用聚合酶，一般用Taq DNA聚合酶；聚合酶；⑥⑥能严格控制温度变化的温控设备能严格控制温度变化的温控设备2)PCR过程过程①①高温变性高温变性当温度上升到当温度上升到90 ℃以上时，双链以上时，双链DNA解聚为单链解聚为单链2．．PCR的过程的过程②②低温复性低温复性温度下降到温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链条单链DNA结合，形成局部双链。

结合，形成局部双链③③中温延伸中温延伸温度上升到温度上升到72 ℃左右，在左右，在Taq DNA聚合酶的作用下，以四聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的5′端端→3′端延伸合成与模板互补的端延伸合成与模板互补的DNA链(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性、中温延伸的每一轮循环包括高温变性、低温复性、中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的延伸而成的DNA单链会与引物单链会与引物Ⅱ结结合，进行合，进行DNA的延伸，这样，的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列，使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增序列呈指数扩增2)PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目为的序列数目为2303．．PCR的结果的结果下列有关下列有关PCR技术的叙述不正确的是技术的叙述不正确的是 (　　　　)。

A．聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增．聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术片段的技术B．在用．在用PCR技术扩增技术扩增DNA时，时，DNA的复制过程与细胞内的复制过程与细胞内 DNA的复制类似的复制类似C．．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及模板以及 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸D．．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复 性、延伸性、延伸【【巩固巩固1】】解析解析　　PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩是聚合酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增增DNA片段的技术在用片段的技术在用PCR技术扩增技术扩增DNA时，时，DNA的的复制过程与细胞内复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板的复制类似，也需要提供模板(母母链链)、酶、原料、能量等条件酶、原料、能量等条件PCR一般要经历三十多次一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步答案答案　　C先用先用___________在在___________中依次加入各组分：中依次加入各组分：____ _____ 、耐高温的、耐高温的___________ 、脱氧核苷酸贮备液、、脱氧核苷酸贮备液、 ___________ 、、_____。

第一次循环：第一次循环：___℃预变性预变性5 min→ ___ ℃复性复性1 min→ ___ ℃延伸延伸1 min；重复；重复30次：次： ___ ℃变性变性30 s→ ___ ℃复性复性30 s→ ___ ℃延伸延伸1 min；最后一次循环：；最后一次循环： ___ ℃延伸延伸7 min，，反应产物在反应产物在___ ℃保存PCR技术的实验操作技术的实验操作1．．PCR扩增前的准备扩增前的准备2．．PCR扩增循环扩增循环微量取样器微量取样器微量离心管微量离心管模板模板DNA聚合酶聚合酶PCR缓冲液缓冲液引物引物DNA955572955572724 PCR操作中模板操作中模板DNA是否需解旋？需要解旋酶是否需解旋？需要解旋酶吗？吗？提示提示　　PCR操作中，模板操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不仍需解旋，但该解旋过程不是解旋酶催化的结果，而是利用是解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在热变性的原理，在80～～100 ℃温度范围内，温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的以此达到解旋的目的[思维激活思维激活2]1．．PCR扩增前的准备扩增前的准备移液移液用微量移液器在微量离心管中依次加入各组用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分：模板分：模板DNA、耐高温、耐高温DNA聚合酶、脱氧聚合酶、脱氧核苷酸贮备液、核苷酸贮备液、PCR缓冲液、引物缓冲液、引物混合混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁，使反应液混合均匀使反应液混合均匀离心离心将微量离心管放在离心机上，离心约将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，，目的是使反应液集中在离心管底部目的是使反应液集中在离心管底部反应：将离心管放入反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应仪中，设置程序进行反应PCR仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可。

仪自动化程度较高，参照下表设计程序即可循环数循环数变性变性复性复性延伸延伸保存保存第第1次次95 ℃℃，， 5 min55 ℃℃，， 1 min72 ℃℃，， 1 min—重复重复30次次95 ℃℃，， 30 s 55 ℃℃，， 30 s 72 ℃℃，，1 min—最后一次最后一次———— 72 ℃℃，，7 min4 ℃℃2．．PCR热循环程序的设置热循环程序的设置若无若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替三个恒温水浴锅的温仪，可用恒温水浴锅代替三个恒温水浴锅的温度分别为度分别为94 ℃、、55 ℃和和72 ℃，然后按照上表要求，在三，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管反应的微量离心管1)检测检测PCR扩增效果的原因扩增效果的原因3．检测．检测PCR扩增效果扩增效果理论上理论上DNA扩增呈指数增长，即一条扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环片段循环n次后次后的数目为的数目为2n，但实际可能会有诸多因素影响，但实际可能会有诸多因素影响DNA含量，所含量，所以需要对以需要对DNA含量进行测定含量进行测定2)原理原理DNA在在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与大小与DNA的含量有关，可以利用的含量有关，可以利用DNA这一特点进行这一特点进行DNA含量的测定。

含量的测定(3)检测过程检测过程①①10倍稀释：倍稀释：10 μL PCR反应液，加入反应液，加入90 μL蒸馏水，即将蒸馏水，即将样品进行样品进行10倍稀释②②对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，处，将紫外分光光度计的读数调节至零将紫外分光光度计的读数调节至零③③测定：取测定：取DNA稀释液加入到厚度为稀释液加入到厚度为1 cm的比色杯中，测的比色杯中，测定定260 nm处的光吸收值处的光吸收值有关下列操作过程的叙述，错误的是有关下列操作过程的叙述，错误的是 (　　　　)A．．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸 馏水等在使用前必须进行高压灭菌馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储储 存存C．．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂 后，移液器上的枪头都必须更换后，移液器上的枪头都必须更换【【巩固巩固2】】解析解析　为了防止外源　为了防止外源DNA等因素的污染，等因素的污染，PCR实验中使用实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头，即使用一次性枪头，即A、、B、、D正确。

在冰箱中放置的缓冲正确在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即速融化，即C错误答案答案　　C 美国科学家穆里斯发明了美国科学家穆里斯发明了PCR技术PCR技术是一种技术是一种DNA分子分子“复印机复印机”，它可以在数小时内将一个，它可以在数小时内将一个DNA分子分子复制出复制出1千亿个，解决了检测样本扩增的难题在人类基千亿个，解决了检测样本扩增的难题在人类基因组计划实施中，因组计划实施中，RCR技术使每个核苷酸的识别成本降低技术使每个核苷酸的识别成本降低至至5～～10美元穆里斯因发明美元穆里斯因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖技术而荣获了诺贝尔奖1)DNA复制时需要大量的复制时需要大量的________作原料，在作原料，在DNA聚合聚合酶的催化下以解旋后的单链为酶的催化下以解旋后的单链为________进行生物合成进行生物合成例例1】】示例示例一　一　PCR的原理的原理(2)在在DNA分子解旋时必须加热，普通的酶容易分子解旋时必须加热，普通的酶容易________，，莫里斯从温泉中找到了耐莫里斯从温泉中找到了耐95 ℃高温的高温的________，解决了酶，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。

每次循环可分为重复使用的难题，使链式反应成为可能每次循环可分为________、、________、、________三步思维导图：思维导图：深度剖析深度剖析　　DNA复制的模板是复制的模板是DNA分子的每一条链，并以分子的每一条链，并以脱氧核苷酸为原料，在脱氧核苷酸为原料，在DNA聚合酶的作用下进行复制由聚合酶的作用下进行复制由于在体外打开双螺旋结构，需要加热处理，因此，选用的于在体外打开双螺旋结构，需要加热处理，因此，选用的DNA聚合酶必须能耐高温聚合酶必须能耐高温答案　答案　(1)脱氧核苷酸　模板脱氧核苷酸　模板(2)变性变性(失活失活)　　Taq DNA聚合酶　高温变性　低温复性　聚合酶　高温变性　低温复性　中温延伸中温延伸方法技巧方法技巧 PCR技术特点：技术特点：①①PCR不需要解旋酶，而生物体内不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；复制时需要解旋酶；②②PCR需要耐热的需要耐热的DNA聚合酶即聚合酶即TaqDNA聚合酶，而生物聚合酶，而生物体内体内DNA聚合酶在高温时会变性；聚合酶在高温时会变性；③③PCR一般需经三十多次循环，而生物体内一般需经三十多次循环，而生物体内DNA复制需要复制需要生物体自身的控制。

生物体自身的控制 使用使用PCR仪具体实验操作顺序应为仪具体实验操作顺序应为 (　　　　)①①设计好设计好PCR仪的循环程序　仪的循环程序　②②按配方准备好各组分按配方准备好各组分③③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分　④④进行进行PCR反应　反应　⑤⑤离心使反应液集中在离心管底部离心使反应液集中在离心管底部A．．②③⑤④①②③⑤④① B．．①⑤③②④①⑤③②④C．．②③⑤①④②③⑤①④ D．．④②⑤③①④②⑤③①思维导图：思维导图：【【例例2】】示例二示例二　　PCR技术实验操作技术实验操作深度剖析深度剖析　　PCR反应的操作步骤一般分为准备反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配包括配制配方及将各配方放于实验台上方及将各配方放于实验台上)―→移液移液―→混合混合―→离心离心―→反应因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了循环程序就可以进行反应了答案答案　　C方法技巧方法技巧 PCR技术操作注意事项技术操作注意事项①①为避免外源为避免外源DNA等因素的污染，等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌②②在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换上的枪头必须更换③③所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部④④PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、分、PCR程序设置不当等，均有可能导致程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败片段扩增的失败⑤⑤PCR扩增的是位于两种引物之间的扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物片段，合理设计引物是是PCR成功的关键成功的关键科学猜想、推测与科学实验是进行科学发现的孪生兄弟，科学猜想、推测与科学实验是进行科学发现的孪生兄弟，二者往往密不可分，二者往往密不可分，DNA复制方式的发现就是如此复制方式的发现就是如此———探究探究DNA复制的方式复制的方式———技法必备技法必备DNA分子双螺旋结构模型提出之后，人们又去探究分子双螺旋结构模型提出之后，人们又去探究DNA是如何传递遗传信息的。

当时推测可能有如图是如何传递遗传信息的当时推测可能有如图A所示的三所示的三种方式1958年，年，Meslson和和Stah 1用密度梯度离心的方法，用密度梯度离心的方法，追踪由追踪由15N标记的标记的DNA亲本链的去向，实验过程是：在氮亲本链的去向，实验过程是：在氮源为源为14N的培养基上生长的大肠杆菌，其的培养基上生长的大肠杆菌，其DNA分子均为分子均为14N—DNA(对照对照)，在氮源为，在氮源为15N—DNA的培养基上生长的的培养基上生长的大肠杆菌，其大肠杆菌，其DNA均为均为15N—DNA(亲代亲代)，将亲代大肠杆，将亲代大肠杆菌转移到含菌转移到含14N的培养基上，再连续繁殖两代的培养基上，再连续繁殖两代(子代子代Ⅰ和子代和子代Ⅱ)后离心得到如图后离心得到如图B所示的结果所示的结果能力展示能力展示图图A图图B请依据上述材料回答下面的问题请依据上述材料回答下面的问题1)如果与对照相比，子代如果与对照相比，子代Ⅰ离心后能分辨出轻和重两条密离心后能分辨出轻和重两条密度带，则说明度带，则说明DNA传递遗传信息的方式是传递遗传信息的方式是________如果子代子代Ⅰ离心后只有离心后只有1条中等密度带，则可以排除条中等密度带，则可以排除DNA传递遗传递遗传信息的方式是传信息的方式是________。

如果子代如果子代Ⅰ离心后只有离心后只有1条中等条中等密度带，再继续做子代密度带，再继续做子代Ⅱ的的DNA密度鉴定：密度鉴定：①①若子代若子代Ⅱ离离心后能分出中、轻两条密度带，则可以确定心后能分出中、轻两条密度带，则可以确定DNA传递遗传传递遗传信息的方式是信息的方式是________②②若子代若子代Ⅱ离心后不能分出中、离心后不能分出中、轻两条密度带，则可以确定轻两条密度带，则可以确定DNA传递遗传信息的方式有传递遗传信息的方式有________的可能2)他们观测的实验数据如下：他们观测的实验数据如下： 梯度离心梯度离心DNA浮力密度浮力密度(g/mL)表：表：世　代世　代实　验实　验对　照对　照亲代亲代1.7241.710子子ⅠⅠ代代1.7171.710子子ⅡⅡ代代(1/2)1.717，，(1/2)1.7101.710子子ⅢⅢ代代(1/4)1.717，，(3/4)1.7101.710分析实验数据可知：实验结果与当初推测的分析实验数据可知：实验结果与当初推测的DNA三种可能三种可能复制方式中的复制方式中的________方式相吻合方式相吻合答案答案　　(1)全保留复制　全保留复制　全保留复制　全保留复制　①①半保留复制　半保留复制　②②分散复制　分散复制　(2)半保留复制半保留复制标准的标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是大步需要的温度依次是 (　　　　)。

A．．95 ℃、、55 ℃、、72 ℃B．．72 ℃、、55 ℃、、95 ℃C．．55 ℃、、95 ℃、、72 ℃D．．80 ℃、、55 ℃、、72 ℃1.解析解析　当温度上升到　当温度上升到90 ℃(90～～96 ℃)以上时，双链以上时，双链DNA解解聚为单链，称之为变性；当温度下降到聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 ℃(40～～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；结合；当温度上升到当温度上升到72 ℃(70～～75 ℃)时，溶液中的四种脱氧核时，溶液中的四种脱氧核苷酸在苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的合成新的DNA，称为延伸称为延伸答案答案　　A(长春模拟长春模拟)下列关于下列关于PCR的描述中，正确的是的描述中，正确的是 (　　　　)①①PCR是一种酶促反应　是一种酶促反应　②②引物决定了扩增的特异性引物决定了扩增的特异性③③扩增扩增DNA利用了热变性的原理　利用了热变性的原理　④④扩增的对象是氨基酸扩增的对象是氨基酸序列序列A．．①②④①②④ B．．②③④②③④C．．①③④①③④ D．．①②③①②③解析解析　　PCR是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温片段的技术，在高温条件下，把条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温需要耐高温DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。

端连接脱氧核苷酸答案答案　　D2．．右图是右图是PCR技术示意图，请回答技术示意图，请回答下列问题下列问题1)标准的标准的PCR过程一般分为过程一般分为________、、________、、________三大步骤三大步骤2)引物是此过程中必须加入的物引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一质，从化学本质上说，引物是一小段小段________3)将双链将双链DNA________，使之变，使之变性，从而导致性，从而导致________4)引物延伸需提供引物延伸需提供________作为作为原料3．．解析解析　　(1)PCR过程一般分高温变性过程一般分高温变性―→低温复性低温复性―→中温中温延伸三大步骤延伸三大步骤2)引物的化学本质为一小段单链引物的化学本质为一小段单链DNA或或RNA3)将将DNA加热至加热至90 ℃以上，可导致以上，可导致DNA解旋4)引物延伸需提供脱氧核苷酸作为原料以形成引物延伸需提供脱氧核苷酸作为原料以形成DNA单链答案答案　　(1)高温变性　低温复性　中温延伸　高温变性　低温复性　中温延伸　(2)单链单链DNA或或RNA　　(3)加热到加热到94 ℃　双链　双链DNA解旋成两条单链　解旋成两条单链　(4)四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸课堂小结课堂小结。