凝胶色谱柱的基本介绍.doc

目录1凝胶色谱2分类3分子筛效益4凝胶种类及性质5填料合成技术6实验技术 凝胶色谱 高温凝胶色谱仪 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果凝胶色谱法又称分子排阻色谱法凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产分类  根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子， 凝胶过滤色谱柱如多糖类化合物凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的分子筛效益  一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应具有多孔的凝胶就是分子筛各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。

凝胶色谱法原理 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效应凝胶种类及性质  （一）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶交联剂越多，孔隙越小聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由日本tosoh的TSKGEL的pw系列，适合蛋白和多糖的纯化。

即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶聚丙烯酰胺（PAM，polyacrylamide）聚丙烯酰胺简称PAM，分子量100～500万聚丙烯酰胺主要有两种商品形式，一种是粉末状的，另一种是胶体，还有聚丙烯酰胺乳液 (上海合成树脂研究所研制) 易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺当浓度超过10％以后．就会形成凝胶状结构提高温度可以稍微促进溶解，但温度不得超过50℃，以防发生分子降解难溶于有机溶剂温度超过120 ℃时分解中性，无毒用作增稠剂、絮凝剂、减阻剂，具有凝胶、沉降、补强等作用贮存于阴凉、通风、干燥的库房内，防潮、避光、防热存放时间不宜过长 凝胶色谱 （二）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴ Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

⑵ Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质三）琼脂糖凝胶琼脂糖 Agarose，缩写为 AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖琼胶糖化学结构由β-D-吡喃半乳糖 (1-4) 连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基单位构成把琼脂糖，即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂，溶于热水，冷却制成的凝胶制成的小颗粒用于凝胶过滤适于用sephadex不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用5％以下浓度的凝胶，也能够分级分离细胞颗粒、病毒等利用其吸附性小的特点，有时用它代替琼脂、以作为免疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物琼脂糖凝胶商品名很多，常见的有， 凝胶色谱柱Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国，Bio-Rad）等琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理 （四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。

填料合成技术  凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学改性的发展近年来在这方面有较多的新产品，中国也有许多单位在研制和生产高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面 四种多孔硅胶的理论塔板数 高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外，对粒度分布也要求相当窄用一般的制备方法往往得到粒度较宽的产品，需要进一步过筛当填料的粒度在30微米以下时，这种过筛非常困难，已经成为填料制备上一个较大的技术难关Kirkland，最近利用了尿素和甲醛在酸性介质中形成大小均匀的液体高聚物，加入某种硅溶胶时，硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到由微粒硅珠堆积而成的多孔填料这种堆积硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔径决定于原始硅溶胶的规格，用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料柴志宽等则利用一种硅胶制成粒度分布窄的填料后，再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填料从这些方法制得的微球填料，粒度分布可以达到相当窄，所以可以不经筛选直接使用 用GPC和GPC-LALLS得到PS标样分子量比较 随着进样技术和色谱柱接头设计的改进，现在已经可以得到柱效每米在八万到十万的凝胶色谱填料。

Wheals用四种GPC用的微球硅胶装填色谱柱，都能达到每米八万到十万块塔板数的高效他用这种色谱柱有效地进行了案件侦查中所要求的分析问题实验技术  （一）层析柱凝胶渗透色谱仪 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000二）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。

凝胶的粒度也可影响层析分离效果粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好，脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气四）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好五）防止微生物的污染凝胶色谱分析图 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：⑴ 叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。

叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质⑵ 可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效⑶ 乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01％在微酸性溶液中最为有效重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果⑷ 苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用研究动向  最近凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、。