全身用药的毒性评价.ppt

全身用药的毒性评价杨 斌 2012.05.05〖 新药评价的核心 〗↑ ↑ ↑ 安全有效质量可控毒 理 学药 理 学 药 学----------------------------------------------------------致癌性遗传毒性生殖毒性局部耐受性、过敏、依赖性、免疫毒性光敏和其它试验等 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等，为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护措施、保证受试者用药安全毒理学局部用药毒性全身用药毒性急性毒性长期毒性特殊毒性目 的全身用药毒性概念：指药物经过不同给药途径吸收入血后 所引起全身各组织和器官的毒性反应意义：是药物非临床安全评价的最基本内容内容：包括急性毒性评价、长期毒性评价和其他第一节 急性毒性评价急性毒性试验（acute toxicity test）又称单次给药毒性试验 ,是研究动物一次或24小时内多次给予受试物后，一定时间（14天）内试验动物所产生的毒性反应(死亡或明显毒性)一、 概述Ø获取新药毒性反应信息：通过观察急性中毒症状，对阐明药物的毒性作用（大小和性质）和了解其毒性靶器官具有重要意义。

Ø为长期毒性和特殊毒性试验的剂量设置提供依据：所获得的信息对长期毒性试验的剂量设置和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，也能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息目的和意义应遵循“具体问题具体分析”的原则二、基本内容动物1.动物合格（要求？）2. 至少两种哺乳动物，啮齿和非啮齿类动物各一种3.受试药物为儿童拟用药必要时应采用幼年动物4.雌雄各半，受试药物为拟单一性别药物则需要选 用单一性别动物5.动物初始体重不应偏差平均体重超20%（一）实验动物的选择和受试物上下颌只有1对门齿， 喜啮咬较坚硬的物体， 门齿无根，能终生生长 受试物1.制备工艺稳定，符合临床试验用质量标准规定2.注明受试物名称、来源、批号、含量（规格）、保存条件及配置方法，并附自检报告3.所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求一）实验动物的选择和受试物剂量 通常选择4个以上的剂量，希望其中至少3个剂 量组落在10%-90%的死亡范围之内1.通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期 毒性中值2.对于全新结构的药物或中草药复方，可先通过小 批量动物的摸索，找出0%及100%估计致死量。

二）给药剂量水平、途径、容量• 4-5个剂量组，同时设空白和（或）溶媒（ 辅料）对照组• 剂距以0.65-0.85为宜• 小鼠每组10只（雌雄各半），大鼠不应少6 -8只 • 限量 口服急性毒性是5g/kg,注射是2g/kg（二）给药剂量水平、途径、容量途径• 给药途径至少包括临床拟用途径和一种能使原型药物较完全进入循环系统的途径• 口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4 -6h，一般要求一夜停食(不停水，12) h，投药后再停食3-4h二）给药剂量水平、途径、容量容量各给药途径的容量一般为小鼠0.4—0.5ml／20g(体重)，大鼠lml／l00g(体重)小鼠口服最大容量不超过0.8ml／20g(体重)，其他途径不超过0.5ml／20g(体重)大鼠口服最大容量不超过2ml／l00g(体重)，其他途径不超过lml／l00g(体重)二）给药剂量水平、途径、容量观察时间• 给药后几小时内应严密观察动物反应，以后每天上下午各观察一次• 急性毒性试验必须观察7-14天，一般不超过两周（三）观察时间及指标观察指标给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观 察异常毒性症状包括①行动：不安定、多动、发 声；②神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失 调、姿态异常；③自主神经系统反应：眼球突出、 流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼 吸；④死亡。

三）观察时间及指标应每日记录体重、毒性反应和死亡情况，濒死 动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察 和病理组织学观察试验结束存活动物也进行 解剖，如有病变进行组织学观察四）结果处理和分析评价二、急性毒性试验常用试验方法• 最大给药量法 • 近似致死计量法 • 固定剂量法 • 半数致死量法 • 上下法 • 累积剂量设计法对于某些低毒的受试物可采用该方法在合理的最 大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂 量单次给药或24小时内多次给药(剂量一般不超过 5g/kg体重)，观察动物出现的反应一般使用10-20 只动物，连续观察14天 结果判断：1）无死亡MLD>限度剂量；2）死亡率 限度剂量；3）死亡率>50%，重新设 计一）最大给药量试验以小鼠口服为例： 动物数不得少于10只，雌雄各半，容量一次不 超过0.4ml/10g(体重)，多次给药间隔时间不 低于4h，观察14日，记录毒性反应和体重变化 如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为 该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50 大于最大给药量 （一）最大给药量试验1.根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其 它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。

2.按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表 3.根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围 ，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最 低致死剂量和最高非致死剂量， 4.用二者之间的剂量给一只动物如果该剂量下动物未 发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近 似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量 与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围二）近似致死剂量法（ALD）该方法主要用于非啮齿类的动物试验一般采用6只健康的Beagle犬或猴犬的年龄一般为4-6月龄，猴的年龄一般为2-3岁，选用其他动物时应说明理由• 试验选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量 进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量• 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受 试物后再禁食3-4小时采用一次给药的方式进行 • 如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先 用雌性动物进行预试三）固定剂量法（Fixed-dose procedure） • 根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择 一个作为初始剂量• 若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为 初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束 预试。

三）固定剂量法（Fixed-dose procedure） • 如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物每个剂量试验之间至少应间隔24小时给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天 （三）固定剂量法（Fixed-dose procedure） • 在上述预试的基础上进行正式试验每个剂量至少用10只动物，雌雄各半根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验三）固定剂量法（Fixed-dose procedure） （三）固定剂量法（Fixed-dose procedure） 固定剂剂量法试验结试验结 果的评评价 剂量 mg/kg试 验 结 果存活数2000mg/kg用2000mg/kg试 验2000用500mg/kg试验该化合物无严重急性中毒的危险性预试验：目的是找出0％及100％估计致死量• 设四组以上，每组3-4只，先用1：10的剂量比给药(如5mg／kg、50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定剂量)。

• 观察7日，记录死亡动物数• 然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1：2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg／kg、400mg／kg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100％死亡率 （四）半数致死量法 正式试验 •在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组•其组间剂量的比值，一般在1；0.6至1：0.9范围内•购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜•各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后一日应每日有二人以上同时观察1-2次并及时详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，•第十四日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察四）半数致死量法 LD50和最小致死量及其可信限的计算可采用Bliss法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法计算结果对比表明，不同的计算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异因此，采用较简单的计算方法完全可以满足LD50计算的准确性。

四）半数致死量法 LD50的测定存在明显的不足Ø 动物消耗量大，获得的信息有限； Ø 影响 LD50值的因素较多，不同实验室之间所 得的数据差别较大；Ø 从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的 LD50值，而是更多的毒性信息，如：更多关注 的是动物出现的毒性和剂量间的量效关系四）半数致死量法 第二节 长期毒性评价长期毒性试验（long-term toxicity test）,是试 验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中 毒效应，为观察这种中毒效应而设计的毒理学试 验一、 概述• 观察动物在给予超过临床剂量（数倍或数十倍）和用药周期（ 3-4倍以上）的情况下所出现的毒性反应 • 设法发现引起毒性反应的剂量、剂量与毒性之间的关系、中毒 表现和程度、主要毒性靶器官或组织及可逆程度等• 预测临床研究阶段可能的安全范围和毒性，预先制定防治措施 或避免某些有特殊疾病患者的使用，减少临床可能的风险• 为临床试验初始剂量和指标的选择等提供重要参数 新药报批临床时重点评审项目之一目的和意义长毒与急毒试验的根本差异：• 给药的期限不同• 给药的剂量范围不同• 观察的毒效应不同长毒与急毒试验的根本差异：2.给药的剂量范围不同 长毒试验给药剂量较急毒试验给药剂量小得多 无毒范围LD50>15g/kg 蓄积作用（accumulation action） 药物蓄积（material accunulation） 功能性蓄积（functional accunulation） 长毒与急毒试验的根本差异：3.观察的毒效应不同急毒：死亡 质反应长毒：体重 摄食量 血液学等 量反应量变到质变的过程组成长期毒性实验的三个主要部分是实验动物、 受试药物和观察指标。

长期毒性试验费时、费 力，故必须根据新药类别、受试物性质和用途、 疗程长短、急性毒性试验和长期毒性预试验结果 等周密考虑，精心设计，以避免难以弥补的缺 失 二、基本内容总原则：二种动物、三个剂量 高剂量组应能充分反映药物的毒性 低剂量组不出现毒性反应 同时设已知药物毒性对照组和（或）一溶剂 （或赋形剂）对照组 数量 给药途径 观察指标一般原则和要求1.种类及品系a.应尽可能首先考虑急毒试验已证明的对药物敏感的动 物或品系b.其次考虑受试动物的易获得性，是否具有可查阅的生 理、生化等指标的背景资料及该动物毒代动力学与人 是否相似实验动物现阶段，常按传统习惯，选择易得，易饲养管理、饮食习惯 与人接近或吃一般的食物就可以正常生存的常规动物啮齿类：大鼠首选，豚鼠、地鼠亦用非啮齿类：狗最常用（一类药必须用beagle狗），猴、猫、兔 等亦用我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物：啮齿类首选大鼠，非啮齿类首选狗吸入给药时，猴是首先推荐的动物 Wistar 和Sprague-Dewley（SD）。