用16S_rDNA方法鉴定细菌种属.doc

. 用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA对细菌进展分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作二、实验原理细菌rRNA〔核糖体RNA〕按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进展种属鉴定包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤是一种快速获得细菌种属信息的方法　16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大〔约占细菌RNA含量的80％〕，分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石〞之称在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数一样16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能表达不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家承受。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：细菌培养液基因组DNA16S rDNA片段连接克隆载体阳性克隆鉴定测 序片段回收DNA提取PCR扩增细菌基因组的提取：得到胞内可溶物质菌体破碎纯化DNA别离出DNAPCR的根本原理 ：PCR技术的根本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物PCR由变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制 链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链〞，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤1、细菌基因组DNA提取；2、PCR扩增；3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；4、扩增片段回收；5、DNA片段测序三、结果处理与分析在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光局部切割别离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，那么凝胶为400mg，因此参加的Binding Buffer为1200μl我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属〔1〕NCBI 主页〔〕依次点击进入BLAST〔2〕选择nucleotide BLAST（3） 将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST（4） 点击BLAST后，数据进展提交BLAST 结果如下：图中“Evalue〞 指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个〔如Totle score〕都是数值越高相似度越高我组将数据按照Query cover从100%开场从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据〔5〕导出数据数据导出格式选择FASTA：（6） 选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌（7） 下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG（8） 通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中（9） 选择W 中Align DNA，然后点击OK〔10〕选择Date中的MEGA Format，生成meg文件（11） 翻开.meg文件（12） 生成进化树（13） 导出文件，我组导出PDF格式2、 进化树B1应该属于Proteus〔变形杆菌属〕电泳图谱：从右数第四个条带为本组电泳条带，条带清晰且明亮，无明显拖尾以及弥散，说明DNA提取和PCR扩增非常顺利，所得目的片段完整，数量较多。

四 交流与讨论1.细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16S rRNA进展提纯测序2.用试剂盒提取RNA，一定要注意盒药品名称，不要弄错3.提取DNA过程中，参加GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡4.制作PCR扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失5.我组的DNA电泳虽然亮度略低，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好6.PCR反响五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞DNA复制的引物为一段RNA链〕、酶、dNTP、模板和缓冲液〔其中需要Mg2+作为聚合激活剂〕。

通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16Sr DNA法，虽然按照试剂盒进展实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作同时，操作过程中严格按照步骤进展，注意试剂的使用不要出错电泳图谱中第一块胶是提完DNA之后、进展PCR之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带的说明提取到了DNA，第二块胶是PCR胶，条带明亮而集中不弥散的说明PCR扩增顺利提取到DNA，但PCR胶无条带的可能是由于构建PCR体系时所加试剂有误制作进化树时需要用到英文以及一些软件，学会浏览英文，自学使用不熟悉的软件解决问题将成为将来科研工作道路中的重要技能。