过瘤胃体外模型的测定方法.docx

过瘤胃体外模型的测定方法过瘤胃体外模型的测定方法一、体外一、体外-人工模拟消化液法人工模拟消化液法1，人工唾液配方，人工唾液配方(MeDougall，，1948)-用来模拟动物口腔，测定过瘤胃前的释放率注：MgSO4（MgC12）准确称取一定质量 1.0g(精确至 0.0001g)样品放入 250ml 碘量瓶内，每个样做三个重复，加入200ml 人工唾液，溶于少量蒸馏水中定容至 1000ml)，盖紧胶塞，在 39℃的恒温水浴锅内分别消化0、6 和 12 小时(消化过程中每隔 1 小时振动 1 次)，测定溶液中产品的含量，从而求得过瘤胃产品的释放率 （先将除 CaCl2以外的物质充分溶解，再将 CaCl2溶解后倒入前者溶液中使用前向其中通入二氧化碳，使其 pH 在 8.2 左右并在 39℃的水中温浴 30 分钟 ）McDougall E I. Studies on ruminant saliva, 1. The composition and output of sheep’s saliva. Bilchemical Journal, 1948, 43: 99- 109.2，人工模拟瘤胃液、真胃和十二指肠消化液，人工模拟瘤胃液、真胃和十二指肠消化液准确称取一定质量(精确至 0.0001g)过瘤胃产品，放入 50mL 具塞试管底部，加入 20mL 人工模拟消化液(pH 为 6.6、5.4 和 2.4 的缓冲溶液，分别模拟动物瘤胃、真胃和十二指肠消化道近端的消化液)，盖紧试管塞，在 39℃的恒温水浴摇床内消化 0、12、24、48 小时，取出后冲洗、过滤，滤液定容，测定滤液中产品的含量。

计算公式计算公式:产品瘤胃释放率(W1)=A2/Al x 100%式中:Al-产品中有效成分的含量；A2-产品在 pH 6.6 缓冲溶液滤液中有效成分的含量产品小肠释放率(W2)=A3/A1 x 100%式中:A3-产品在 pH 2.4 缓冲溶液滤液中有效成分的含量产品有效释放率（%）=(l-W1) x W2x100%Papas A M,Sniffen C J,Muscato T V. Effectiveness of rumen protected methionine for delivering methionine postruminally in dairy cows [J]. J Dairy Sci, 1984a, 67: 545~552.附：人工肠液的制备磷酸氢二钾胰蛋白酶胰脂肪酶胰淀粉酶氢氧化钠6.8g0.25g9.375g83.3mg调 pH注：先将磷酸氢二钾加 500ml 水溶解，加入胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等，再定容至1000ml，用 0.1M 氢氧化钠调至适宜 pH（6.0-8.0） ；二、体外、体外-瘤胃液培养法瘤胃液培养法1，瘤胃液的采集，瘤胃液的采集晨饲（6：00）后 2 小时，由瘤胃内采集足量瘤胃液灌入经预热达到 39℃并通有 CO2的保温瓶中灌满后，立即盖严瓶口迅速返回实验室，经 4 层纱布过滤后，持续充入 CO2气体 5 分钟。

然后，迅速分装至上述已预热好并通有 CO2的培养瓶内，每个培养瓶加 20ml 瘤胃液，盖紧瓶塞放入 39℃水浴摇床培养2，瘤胃培养底物的制备，瘤胃培养底物的制备培养底物组成：淀粉 3g，氯化铵 0.1729g，无水硫酸钠 0.0269g，以上试剂为分析纯3，瘤胃缓冲液的制备，瘤胃缓冲液的制备体外批次培养的培养体系为 60mL，其中瘤胃液与缓冲液的比例为 1：2，培养底物的添加量为0.5g采取 McDougall 缓冲液每 10LGIF 缓冲液含（g）：98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O4，测定方法，测定方法称取胆碱样品 lg 左右，放入已经加入瘤胃液和培养液的培养瓶中(250ml)，摇动混合，向溶液充CO2，使溶液和试管内空间全部充满 CO2，然后盖上带有放气阀门的橡皮塞，将其置于水浴摇床培养(39℃)，设置好摇床频率，分别于 2、4、8、16、24h，每个样品取出 6 个瓶子，倾去上清液，剩余物用自来水冲洗三次，至水澄清，除三个样品用于下一阶段的试验，其余三个样品 65℃烘干至恒重(48h)，移至干燥器内 15min 后称重，进行剩余物中胆碱含量，从而测定瘤胃降解率。

三、半体内法三、半体内法-尼龙袋法尼龙袋法1，尼龙袋的制作，尼龙袋的制作选择孔径为 35-50μm(250 目-400 目)的尼龙布，裁剪成 15cm x 11cm 的长方块，对折，用涤纶线进行双道缝合，制成长 x 宽为 7cm x10cm 的尼龙袋边缘用烙铁熨烫，使其无散边，密封，用油性笔标号，再用自来水冲洗，浸泡 50 分钟，然后低温烘干至恒重，备用十二指肠尼龙袋：选择孔径为 35~50μm 尼龙布，裁成 7 x 6cm 的长方形，对折，然后用尼龙线或涤纶线缝双道，制成 6 x 2.5cm 尼龙袋2，实验方法，实验方法选用永久性瘘管反刍动物，分别测定不同包被产品在 3，6，9，12，24h 时间点的降解率每个时间点设 3 个重复预饲期 14 天，试验期 4 天，每一试验期结束后转入下一期的预饲期3，尼龙袋消化试验及样品的采集制备，尼龙袋消化试验及样品的采集制备将尼龙袋用清水洗净，于 65℃烘箱中烘 48h，放入干燥器中冷却称重、标号于每一尼龙袋中准确称取包被产品，每个样品 3 个重复，每 3 个平行袋固定在一条小铁链上，按一次投入、在不同时间点取出的原则将尼龙袋分别进行 0，3，6，9，12，24h 瘤胃培养。

将尼龙袋从瘤胃中取出，用自来水冲洗，将尼龙袋表面的瘤胃内容物及残渣冲洗，停止微生物活动，直至冲洗干净，冲洗过程不能用手挤压袋内样品，以免增大消失率将尼龙袋放入 65℃）恒温真空干燥箱内烘干至恒重，然后将烘干恒重的尼龙袋残余物磨碎，-20℃保存待测具体操作程序参考 rskov 等（1980）的方法Rskov E R, DeB Hovell FD, Mould F .The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs [J].Animal Production, 1980, 5(3):195-213.四四、体外、体外-小肠液冻干粉小肠液冻干粉1，，小肠液冻干粉（小肠液冻干粉（GIF））的制备的制备牛/羊屠宰后立即收集全小肠食糜(十二指肠-回肠末端)，立即放在-50℃冷库中速冻，回到试验室后经冷水解冻，用双层纱布过滤后，于 4℃，4000r/min 离心约 15min，用吸管吸去上层浮油，将上清液倒入表面皿中，置于 FTS 冻干机冻干，然后将冻干粉迅速分装于可封口塑料袋内，-20℃保存2，，McDougall 缓冲液的配制缓冲液的配制每 10LGIF 缓冲液含（g）：98g NaHCO3，93g Na2HPO3，4.7g NaC1，1.2g MgSO4·7H2O，5.7g KCI，0.4g CaC12·H2O，用 0.2M 盐酸调至 pH 7.0。

3，胰蛋白酶活性和淀粉酶的检测，胰蛋白酶活性和淀粉酶的检测胰蛋白酶和淀粉酶的活性测定参照南京建成生物试剂盒说明书的测定方法进行4，操作方法，操作方法a.过瘤胃产品非降解残渣的制备称取一定质量 1.0 g(精确至 0.0001g)过瘤胃胆碱于尼龙袋内，饲喂后 1~2h，将尼龙袋投入到装有永久性瘤胃屡管牛/羊的瘤胃内，每只放 4 个尼龙袋，待饲料在瘤胃内培养 16h 取出，在-20℃保存备用b.测定方法取出上述样品，解冻，冲洗干净，分别放入 50mL 三角瓶中，加入提前预热至 39℃含 o.4gGIF(与试验得出，McDougall 缓冲液中 GIF 的用量为 0.4g/30mL)的缓冲液 30mL，放入 39℃恒温水浴摇床内中速振荡 16h，取出冲洗，65℃烘干，然后测定残渣中氯化胆碱的含量16 h 为人工瘤胃体外培养最佳时间也是精料在瘤胃内的滞留时间）5，计算公式，计算公式瘤胃释放率 W1(%)=(A1-A2)/A1xl00%小肠消化率 W2(%)=A3xl00%过瘤胃有效释放率(%)=(l-W1)xW2x100%式：Al一袋中氯化胆碱起始质量；A2一袋中残渣中氯化胆碱.的质量；A3一产品在小肠冻干粉缓冲液中的氯化胆碱释放率。

五、体内五、体内-真胃和小肠释放率真胃和小肠释放率-移动尼龙袋法移动尼龙袋法将 1.0g 过瘤胃氯化胆碱样品装入十二指肠尼龙袋（6 cm x 2.5 cm）中，放入 39℃、pH 为 2 的 0.2%的HCl-胃蛋白酶溶液(6 ml 盐酸用蒸馏水稀释至 1000ml，加热到 39℃后加入胃蛋白酶 2g，混合均匀)中2.5 h，然后放入十二指肠瘘管内，从粪中回收，冲洗，然后放入 40℃烘箱内，烘至恒重，备测Rossi F, Maurizio M, Francesco M, et al. Rumen degradation and intestinal digestibility of rumen protected amino acids: comparison between in situ and in vitro data [J].Animal Feed Science and Technology, 2003, 108: 223~229.。