甲胺磷降解菌的筛选与鉴定.docx

甲胺磷降解菌的筛选与鉴定I第一作者：王硕，男，1969年生，教授，博士生导师，主要从事食品安全研究 国家科技支撑计划资助项H (NO.2006BAD05A06)：食品加工关键技术研究与产业化开发(2006BAD05A06)王硕I郭睿莉杜欣军闫艳平(天津科技大学食品T程与生物技术学院，食品营养与安全省部共建教冇部重点实验室，天津300457) 摘要 分别利用甲胺磷作为唯一碳源和唯一氮源的培养方法，从山东某农药厂活性污泥中筛选分 离岀12株甲胺磷降解菌采用气相质谱法测定各菌株的降解效能，从中选取降解效果较好的4号菌 (MAPD-4)和10号菌(MAPD-10)作进一步研究，分别对MAPD-4. MAPD-10的16S rDNA进行测 序和序列比对结果显示，MAPD-4与窗萄球^^(Staphylococcus)的同源性为97%, MAPD-10与产碱 菌属(Alcaligens)^］同源性为99%MAPD-4和MAPD-10的最适生长温度均为30 C,最适pH分别为 7.0、6.0o在甲胺磷(质量浓度为1 ()0 mg/L)为唯一碳源的无机盐培养基中培养15 d,测得MAPD-4、 MAPD-1 ()的降解率分别为64%、49% o关键词甲胺磷降解菌筛选16S「DNAScreening and characterization of methamidophos degrading bacterium Wang Shuo, Guo Ruili, Du Xinjun, Yan Yanping. (Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457)Abstract： Twelve bacteria capable of degrading methamidophos were isolated from activated sludge of a pesticide factory in Shandong province. These strains could use methamidophos as the sole carbon and nitrogen source. The residual strain was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry, and the results showed that the MAPD-4 and MAPDhad better degrading activities and been chosen for further research. Blast analysis showed that the MAPD-4 and MAPD-10 were belonged to Staphylococcus and A lea I i gens respectively. The optimal temperature of MAPD-4 and MAPE-10 were 30 C and the optimal pH were 7.0 and 6.0, respectively. 64% and 49% methamidophos could be degraded by the two strains within 15 days using methamidophos as the sole carb on source.Keywords： methamidophos； degrading・bacteria； screening； 16S rDNA甲胺磷又名多灭灵，化学名称为O, S■二甲基胺基硫代磷酸酯，是一种具有触杀、胃 毒和一定熏蒸及内吸传导作用的长残效、广谱、剧毒的有机磷杀虫剂⑴。

可用于防治水稻、 棉花、玉米等作物的多种虫害［2］, -K杀毒机制是抑制害山体内的乙酰胆碱酯酶活性［341 - 由于甲胺磷农药对乙酰胆碱酯酶非选择性的强烈抑制作用，因此这一农药对于人畜具有较 高毒性虽然我国农业部己做出公告，自2007年1月1 H起全而禁止甲胺磷、对硫磷、 甲基对硫磷等5种高毒农药的使用⑸，但是由于其良好的杀虫效果，仍然有一些不法分子 在违禁生产、销售这些农药；另外，多年來我国农作物生产上大量使用这些高毒有机磷农 药，致使其产生的危害在长时间内还将继续存在这些原因造成粮食、经济作物有机磷含 量超标，不能达到国际贸易的标准，从血使我国农产品在国际市场上缺乏竞争力，这不仅 造成巨大的经济损失，也对我国农业经济的可持续发展造成重人影响⑹，因此寻求降解甲 胺磷的有效方法消除其引起的粮食安全问题、国际贸易问题仍然非常必要H前，我国受残留农药污染的土地而积大，仅采用化学方法处理费用太高且会造成新 的污染大量研究证明，微生物对土壤和水中的有机磷农约均有很好的降解作用，且不会 造成二次污染⑺叫 因此如何利用微生物降解⑼⑼土壤中的残留甲胺磷，对改善农产品的 质量，提高人民生活水平具有重大的研究价值。

笔者从山东某农药厂的活性污泥中，筛选 出2株降解甲胺磷的有效菌株，并对其降解性能进行研究，将为有机磷农纱降解的深入研 究奠定基础1实验材料与方法1.1试验材料1」」土样来源活性污泥采集于山东某农药厂污水处理池1.1.2甲胺磷来源农药甲胺磷购于农业部药检所，纯度99%o1.1.3培养基(1) LB培养基(富集培养基)：蛋白腺0」％,酵母浸膏粉0.5%, NaCl 1.0%； pH=7.20(2) 无机盐培养基 a： KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.15%, MgSO4-7H2O 0.02%, NaCl 0.05%, (NH4)2SO4 0.02%, MnSO4 0.05%, FeSO4 0.05%, CaCl20.01%o(3) 无机盐培养基 b： KH2PO4 0.05%, K2HPO4 0.15%, MgSO4-7H2O 0.02%, NaCl 0.05%, MnSO4 0.05%, FeSO4 0.05%, CaCl20.01%o(4) 无机盐I古I体培养基：在无机盐培养基a、b的基础丄加入1.5%琼脂1.2试验方法121菌种的分离与筛选(1) 将从山东农药厂采集到的表层污泥、深层污泥和土壤等比例称取().5 g,分别加入 到以甲胺磷为唯一碳源和唯一氮源的5() mL无机盐培养基中(甲胺磷的质量浓度为100 mg/L),于 30 C, 150 r/min 培养。

2) 以后每周转接1次，以10%的接种量接入新鲜培养基中，每次接种提高甲胺磷浓 度，以100 mg/L的梯度递增，直到质量浓度增加至500 mg/Lo然后将甲胺磷的质量浓度 保持500 mg/L,继续转接培养数周3) 如此驯化1个月，最后用平板划线法在含甲胺磷的无机盐固体培养基上进行细菌 分离纯化选取在农药培养基中生长快，菌落规则，传代稳定的单菌落转入LB液体培养 集中富集，过夜培养后，每株菌取900(iL于1.5 mL的无菌离心管中，并加100(1L 80%的 无菌甘油于0 C保存，其余的进行降解性能测试1.2.2种子液的制备将降解菌挑单菌落接种于5mL含甲胺磷LB培养基中,30 C, 150r/min,过夜培养, 然后于8 000r/min, 4 C离心5 min,弃上清液，并用无机盐培养基洗涤沉淀，最后将菌体 悬浮于1 mL的无机盐培养基，待用1.2.3菌种的降解实验50mL无机盐培养基中加入100mg/L的甲胺磷，再加入ImL种子液,空白培养基中加 入ImL无菌水代替菌液，于30C, 150r/min培养，分别于第0、5、10、15天测其降解率1.2.4甲胺磷含量的检测GC/MS 4000 (美国瓦里安公司)，气相质谱检测条件如下⑴•叨：(1) 进样口：进样口温度260 C ；分流比5.0。

载气为氨气，纯度99.9%o(2) 柱温：柱温采用程序升温，起始温度150 C,然后每分钟升高10 C,直到260 C3) 柱流速：0.8 mL/mino(4) 传输线温度:280 C o(5) 离子阱温度:220 C o(6) 离子源:EI源1.2.5降解菌的鉴定提取细菌的DNA[13, 14],以总DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增【①，所用引物根 据细菌16S rDNA保守序列设计，引物序列为：16S F： 55AGAGTTT GATCCTGGCTCAG 3\ 16S R： 5，GGTTACCTTGTTACGACTT37 将扩增 DNA 片段回收后，连接到 PGEM-T Easy 载体并转化DH5a,筛选阳性菌落进行测序，将测序结果在NCBI数据库小进行序列比对, 确定菌株种类1.2.6最适生长条件测定⑴最适pH测定将过夜菌按1： 100接入新鲜的LB液体培养基中，培养基pH分别 为 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 30 C、150r/min 培养 8 h 后,测定吸光度(OD600),确定最 适pHo(2)最适生长温度测定在其最适pH条件下，按照上述方法，分别测定这两株菌在25、 30、35、40 C培养后的吸光度(OD&oo),确定最适生长温度。

2结果2.1降解菌的分离与筛选通过富集和筛选，分离出12株甲胺磷降解菌采用气相质谱法测定各菌株的降解效 能，并选取降解效能最高的MAPD-4和MAPD-10作为试验菌株2.2降解菌的降解效果经气相质谱测定，甲胺磷降解菌MAPD-4和MAPDJ0在培养15d后，分别能降解培 养基中64%和49%的甲胺磷2.3降解菌的分子水平鉴定分别提取MAPD-4和MAPD-10的DNA,经过16S rDNA PCR扩增后，得到总长度 均为1.5 kb的扩增产物，测序并对测序结果进行BLAST序列检索结果表明，MAPD-4 与葡萄球菌属(Staphylococcus)的同源性为97%, MAPD-I0与产碱菌属(Alcaligens)的同源 性为99% o2.4菌种最适生长条件的测定2.4.1培养基初始pH对菌体生长的影响经测定MAPD-4的最适pH为7.0,血MAPD-10的最适pH为6.0 (见图1 )MAPD-4 T-MAPD-10pH图1 pH对菌体生长的影响Fig.l The effect of pH on growth of the 4th and 10th bacteria2.4.2培养温度对菌体生长的影响经测定，MAPD-4和MAPD-10的最适温度均为30 C (见图2)。

温度/C图2培养温度对菌体生长的影响Fig.2 The effect of temperature on growth of the 4th and 10th bacteria农药厂污水处理池中的活性污泥中含有人量微生物，这些微生物长期受到污水中残留 农药的驯化，因此活性污泥是一种分离农药降解微生物的有效实验材料，与农田土壤相比, 从活性污泥中获特高活性降解菌的几率更高FI前，很多本领域的研究都是以农药厂活性 污泥为实验材料［⑹经调查，山东某农药厂曾长期生产甲胺磷，因此本研究以该农药厂的 活性污泥为材料进行甲胺磷降解菌的筛选从FI前的研究来看，某--类农药的降解菌没有一定的规律，即同一农药的降解菌似乎 不存在相近的遗传关系仅就甲胺磷降解菌来看，能够降解这一农药的微生物有于蜡样芽 胞杆菌(Bacillus cereus)> 巨大芽彳包杆菌(Ba。