实验四凝胶过滤法分离蛋白质.docx

实验四 凝胶过滤法分离蛋白质课程名称：生物化学与分子生物学实验课专业、层次：临床医学本科职称：讲师基本教材：自编 《生物化学与分子生物学实验指导》年级： 2005授课教师：符伟玉学时： 4 学时教学目的与要求：1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作3、掌握凝胶过滤与 PAGE 中分子筛效应的区别大体内容与时间安排：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理 10min2、凝胶过滤法的操作示范及注意事项 10min3、学生做实验140min教学方法： 讲授式 +启发式教学重点、难点：重点： 1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理2、凝胶过滤与 PAGE 中分子筛效应的区别3、实验操作中的装柱难点： 1、凝胶过滤与 PAGE 中分子筛效应的区别2、实验操作中的装柱一、实验原理凝胶过滤又叫分子筛层析层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成蛋白质溶液加于柱之顶部， 待其与柱充分接触后随洗脱液往下渗， 小分子蛋白质进入小孔内， 因而在柱内停留的时间长， 大分子蛋白质不能进入小孔径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离 本实验高铁血红蛋白分子量大， 不易渗入颗粒小孔，被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。

高铁氰化钾【 K 3Fe(CN)6】分子量小，渗透到颗粒小孔的内部，洗脱时间长，后流出这样就可以达到分级分离的目的在血红蛋白 (Mw ＝ 64 500)中加入过量的高铁氰化钾 (K 3Fe(CN)6 ， Mw ＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白 (methemoglobin，MetHb)为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的 MetHb 样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到 MetHb(红褐色 )洗脱较快，而小分子高铁氰化钾 (黄色 )洗脱较慢，达到将 MetHb 完全分离出来的目的二、操作步骤1、凝胶准备 称取 5g 交联葡聚糖 G-25，倾入锥形瓶中， 加蒸馏水约 60ml 溶胀，搅动后静置待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复 3 次将溶胀后的凝胶用 10 倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡2、装柱 取玻璃层析柱 (25cm1.5cm)一支，垂直装好加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口然后从管顶向柱内加入缓冲液 8cm 左右高，将平衡后的交联葡聚糖 G-25 悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖 G-25 悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高 20cm 左右时为止。

床面上覆盖 3ml 缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定 5～10min 后，接储液瓶，打开出口，用 2 倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口3、样品处理（ 1）血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血 3ml 离心，吸去上层血浆，加入 5 倍体积的冷生理盐水，混匀后 3 000r/min 离心 5min，弃去上清液，重复2洗 3 次最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇再加 1/2 体积 CCl4，用力振摇 3min， 3 000r/min 离心 5min吸取上层澄清的血红蛋白液备用此溶液中 Hb 浓度约为 10%(置 4℃ 暂存，一周用完 ) 2）样品：血红蛋白液 3 滴加 K 3Fe(CN)6 8 滴和蒸馏水 2 滴混合，制成 MetHb 混合样品4、上样、洗脱：打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口 吸混合物样品 0.5ml 左右，在距离床面 1mm 处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出同上加入 1～ 2 倍样品量体积的洗脱液 (这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内 )，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。

5、分部收集：用自动部分收集器，以 5 滴/min ，10 滴/管的速度进行收集并且观察柱上的色带，待黄色的 K3Fe(CN)6 色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口6、测定：将每管收集液加入蒸馏水至 4ml，混匀，在 425nm 处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管编号为横坐标，绘出洗脱图谱三、注意事项1、装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱2、上样时一定要靠近凝胶柱表面、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层3、收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集4、流速不可太快5、尽量保持各管收集的液量一致6、洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干7、洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃3小 结凝胶过滤（又名：分子筛层析）是分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子的常用手段葡聚糖凝胶（商品名： Sephadex）是最常用的一种具有分子筛作用的物质凝胶过滤主要用于分子量有明显差异的不同物质的分离不同型号（交联度、孔径不同）的 Sephadex应用于不同分子量范围本实验应用 Sephadex G-25分离高铁血红蛋白 (methemoglobin，MetHb) 和高铁氰化钾，得到较纯的 MetHb样品。