简述猪蓝耳病（PRRS）的诊断技术.docx

简述猪蓝耳病（PRRS ）的诊断技术作者：黎先伟 译来源：《兽医导刊》 2015年第10期黎先伟 译迄今为止，无论花费了多大的成本和努力，我们仍没有建立一套有效的预防、控制和清除 猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病，PRRS）的策略不过，对我们兽医工作者来说，掌握最佳的诊 断方法来准确的提前预判猪场蓝耳病稳定与否是非常重要的目前，有什么工具和/ 或手段来 协助我们呢？下面我们将一一阐述猪繁殖与呼吸综合征是一种病毒性、灾难性的传染病其临床表现为母猪严重的繁殖障碍 断奶仔猪普遍发生肺炎、生长迟缓以及死亡率增加等症状猪蓝耳病是一个全球性的问题，对 世界养猪业和经济造成非常重要的影响单单在美国，每年由于猪蓝耳病对养猪业所造成的损 失估计可达到6.64 亿美元为了应对这些挑战，研发和实施一种可靠的、准确的和及时的诊 断措施是有效防控猪蓝耳病的一个重要组成部分随着诊断技术的日益发展，对于兽医和养猪 业的利益相关者来说，继续采取最佳的措施以协调应对疾病的发展，从而保持整个行业的稳定 是非常重要的一、 选择合适的诊断方法选择一种合适的猪蓝耳病诊断方法最为关键的第一步是，确定实施检测的目标这些目标 可能包括在一个群体中检测出至少一头受感染的动物；判断病毒在群体中的流行情况；确定分 离的是野毒还是疫苗毒，或评估感染的时间。

这些因素将取决于待检测的动物、需求样品的数 量以及合适组织的使用此外，个别动物的检测结果可能不能很好的反应整个群体的状态，因 为每个动物感染的状态都有所差异，所以我们在分析结果时必须多加注意二、 选择合适的样本数当选择合适的用于诊断猪蓝耳病的样本数时，需要考虑到多种因素为了从一个群体中鉴 定出至少一份阳性样本，需要考虑的因素包括群体大小、群体内疾病的预期流行率、所需确定 性的程度，以及所采用的检测方法的敏感性和特异性检测的时机也是非常重要的，因为感染和免疫反应的多种方面，包括病毒血症、病毒释放 抗体应答和特征性病变仅会在特定的时间内出现三、选择合适的组织样本一般来说，诊断检测大体分为两类：病毒（抗原）检测和病毒抗体检测病毒（抗原）检 测需要采集富含病毒的组织、支气管肺泡灌洗液（BALF ）、胸腔液、精液、血液、唾液或环境 样本；而病毒抗体检测则需要采集血液（血清）、唾液或肌肉渗出液等，以检测抗蓝耳病抗体 的水平因此，组织样本的选择取决于多种不同的因素，包括特定的检测目的、所选择的诊断 方法和可用的设备四、诊断方法自从发现猪蓝耳病以来，人们已采用过各种不同的技术和/ 或方法来检测猪蓝耳病病毒（PRRSv）及其抗体，目前其中一些诊断技术和/或方法很少用于临床诊断，这有多方面的原因: 首先可能是这种方法更适用于实验室；第二该方法需要耗费过长的时间；第三成本昂贵或需要 专业培训过的人员等等。

在下本中，我们将简要描述现在针对猪蓝耳病主要采用的检测技术， 同时谈及一些较为传统的方法以阐明近几年来诊断技术和/ 或方法已发展到什么程度五、猪蓝耳病病毒（PRRSv）的检测病毒的检测技术可对疾病感染的状态作出一个很好的指示，不过这些技术和/ 方法往往主 要作为实验室研究的工具，因为它们的操作需要经过专业培训的实验人员、而且成本较高以及 所需的时间较长一旦从样本中分离到病毒，可使用特定的细胞系通过一系列的感染和复制从 组织样本中扩增病毒另一种方法就是采用电子显微镜直接观察病毒，不需要通过特定分子或 抗体来识别病毒，这在描绘新病毒株方面具有重要的作用目前，新型、快速和低成本的诊断 技术（见下文描述）已被广泛使用，这些技术对于常规和快速诊断具有更高的实用性和便捷性1. 反转录- 聚合酶链反应（RT-PCR）当怀疑病毒具有垂直传播的特性时，可选择胎儿样本进行反转录-聚合酶链 反应该方法可用于快速的、特异的和高度敏感的从不同的组织（包括血清、精液、唾液、肺 组织、淋巴结、脾脏和扁桃体）和环境样本中检测猪蓝耳病病毒这个方法的主要步骤包括从 组织样本中抽提病毒RNA ； RNA通过逆转录为DNA ； DNA的PCR扩增以及扩增DNA的检测。

反转录- 聚合酶链反应的缺点是组织样本之间和动物之间感染后病毒的检测会有差异此 外，RTPCR的高度敏感性可能会由于样本受污染而出现假阳性，而特定的引物对一些容易变异 的病毒往往容易出现假阴性的结果2. 免疫组化（IHC）免疫组化方法可用于从不同部位的组织（包括肺脏、淋巴结、胸腺、 扁桃体、脾脏和肾脏）中检测猪蓝耳病病毒简单来说，先用福尔马林固定组织样本，随后用 针对病毒核衣壳的单克隆抗体进行标记最后采用一种经标记的第二抗体通过显微镜直接观察 组织中是否存在病毒虽然免疫组化具有高度的特异性（100%），但是其仅有中等的敏感性（67%）不过，在固定的48 h 内处理组织可有效改善免疫组化的敏感性在感染早期，敏感 性的程度是最高的；而在感染后期阶段，敏感性的程度会逐渐下降，如感染后超过28 d,更不 用说感染后超过90 d虽然免疫组化可有效鉴别仔猪中垂直传播的病毒，但是对于一些容易变 异的病毒，这种方法往往难以达到理想的效果3. 荧光抗体染色法（FA）荧光抗体染色法，通常用于评估支气管肺泡灌洗液（BALF）或 新鲜/ 冰冻的肺组织的病毒感染情况，不过目前该方法临床上较少使用在该技术中，样本直 接用荧光抗体进行标记来观察病毒粒子。

对于检测猪蓝耳病病毒来说，这种方法要比免疫组化 法更为快捷和便宜，但是与免疫组化相比，荧光抗体染色法不能检测病毒株的遗传多样性，而 且不推荐在感染后期使用这种方法此外，荧光抗体染色可能也存在假阳性的问题，这可能是 由于原始抗体或高背景染色的特异性较差所造成的4. 临床试纸条检测试纸条检测在猪蓝耳病病毒的诊断中是一种比较新的技术，尽管尚未 得到广泛的应用，但是这种方法可快速、便捷的检测出猪蓝耳病病毒，而不需要专业的知识或 设备试纸条通过免疫层析法检测血清或组织匀浆中的病毒简单来说，这种方法的原理是样 本中的病毒与针对猪蓝耳病病毒特定蛋白的金标单克隆抗体相混合，形成蛋白-抗体复合物聚集 在试纸条内随后用一种经标记的第二抗体检测聚集的蛋白- 抗体复合物目前，这种方法暂 时只适用于有限的病毒六、猪蓝耳病病毒特异性抗体的检测血清中猪蓝耳病病毒特异性抗体的检测是诊断猪蓝耳病最为常用的方法，此外，也可以用 唾液样本或肌肉渗出液来进行检测在美国，自从2010 年以来，采用唾液样本来诊断猪蓝耳 病的比例大幅增加猪蓝耳病病毒抗体的检测是一个不断发展的诊断学科一些方法和/ 或技术与时间和资源 问题有关，目前主要用于实验室研究。

这些方法和/ 或技术包括免疫过氧化物酶单层细胞试验 法（IPMA）, —种高度特异且敏感的方法，而且是首次报道用于猪蓝耳病诊断的血清学方法 在这个试验中，经过氧化物酶标记的第二抗体检测的受病毒感染的细胞中的抗猪蓝耳病病毒抗 体富集于微孔板内随后通过光学显微镜来评估阳性样本同样，病毒中和（VN）会产生难以 解释的结果虽然抗体检测可鉴定出新的猪蓝耳病病毒感染，但是这不适于监测以往受过感染的群体， 因为这种方法无法区别这些是新感染、旧感染还是接种疫苗所产生的抗体1. 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验是检测猪蓝耳病病毒抗体中最为常用的一种方法 2010 年爱荷华州立大学的研究已证实，酶联免疫吸附试验的特异性可高达99.9%，敏感性也能 达到98.8%微孔表面覆盖大量的猪蓝耳病病毒融合（N）蛋白用来捕获组织样本中的抗猪蓝耳 病病毒抗体，随后用过氧化物酶标记的抗体显示捕获的抗猪蓝耳病病毒虽然酶联免疫吸附试验既快捷又方便，但这种方法也有其局限性免疫反应在动物和检测 抗体的水平之间通常是可变的，这不一定能反映病毒的毒力此外，母源抗体和饲料中的抗体 可能也会影响最终的结果早期感染期间的可能会出现假阴性也是需要关注的一个问题。

2. 荧光微球免疫分析法（FMIA）荧光微球免疫分析法是一种多重版的酶联免疫吸附试验, 即采用不同的染色荧光微球来捕获多种抗猪蓝耳病病毒抗体，随后用荧光标记的第二抗体进行 标记这种技术可在单一的小样本中同时检测几种不同的抗体研究结果证实，荧光微球免疫 分析法对血清样本的敏感性和特异性分别可达到98% 和95% 此外，众所周知传统的方法用于 检测唾液样本的敏感性较低，但采用FMIA的敏感性和特异性则分别可达到92%和95%而且对 于早期感染的检测，FMIA要比ELISA具有更高的敏感性3•间接免疫荧光试验（IFA）间接免疫荧光试验与免疫过氧化物酶单层细胞试验法相似， 不同的是使用荧光标记的第二抗体来检测捕获的抗猪蓝耳病病毒抗体研究已表明，间接免疫 荧光试验具有较高的特异性，而敏感性则取决于多种不同的因素，包括用于捕获抗体的细胞类 型、实验室条件和抗猪蓝耳病病毒的抗原性通常情况下，样本进行ELISA检测之后再进行间 接免疫荧光试验以排除假阳性的结果此外，这种方法也可采用唾液和肌肉渗出液样本来进行 试验4. 临床试纸条检测试纸条检测技术除了可用于检测病毒抗原以外，现在这种方法也可用 于检测猪蓝耳病病毒抗体（采用病毒融合蛋白）。

胶体金试纸条技术不仅低成本、快捷和方便 使用，而且不需要昂贵的设备和专业技术人员据报告，这种方法的敏感性和特异性分别可达 到93% 和98%不过，这种方法还没有被广泛使用七、 病毒分离株的特性病毒分离株的特性对于管理者及时做出正确的决策来说往往是非常重要的，如决定是否需 要把养殖场内的动物转移到另一个区域、跟踪病毒的蔓延趋势以及确定是否新的病毒株存在于 猪群内分子生物学技术，包括RFLP和DNA序列分析要比传统方法更准确的分析猪蓝耳病病 毒的特异性八、 序列分析目前，病毒基因组的序列分析是鉴定猪蓝耳病病毒最常选择的方法从血清和受感染组织 的样本中提取的PCR产物进行基因测序和系统进化树分析，这可为病毒株的分析提供最可靠的 数据0RF5序列的高变区用于区分病毒株是最为可靠的，而且0RF5的全基因序列也常用于分 析比对不同的病毒不同病毒株之间的遗传进化关系可通过绘制系统进化树来表示这可有效 反应养殖场群体的感染水平，以监测当地群体内病毒株的变异情况当在群体内发现潜在的新 变异病毒时必须引起高度重视九、猪蓝耳病病毒(PRRSv )诊断的未来要想成功的从猪群中控制和清除猪蓝耳病病毒的感染，我们需要采用常规监测和疾病诊断 相结合的方法。

虽然一系列的诊断技术已有效地成为诊断猪蓝耳病病毒的手段，但是对于所有 的情况和动物，目前仍没有一种检测技术是100% 可靠的随着新技术的不断引入，人们日益 要求确保在合适的时间点对合适的动物进行合适的检测，并采用合理的干预来优化有效的管理 措施，从而最大化的预防或控制疾病的暴发By OlivierDuran)。