NK4慢病毒载体的构建及对人肝癌细胞的生物学特性的影响.pdf

N K 4 慢病毒载体的构建及对人肝癌细胞的生物学特性的影响T h ec o n s t r u c t i o no fN K 4r e c o m b i n a n tl e n t i v i r a lv e c t o ra n dt h ee f f e c to nt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fh u m a nh e D a t o c a r c m o m ac e l l●●1'导师：亓5 ，⋯：一级学科：论文课题起止时间：2Q ! Q 生三月二2Q12 生圣旦中国医科大学( 辽宁)2012 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名：壅壶日期：沙1 1 譬、} ∑中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：日期：j 叫】．”目录一、摘要中文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”1英文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”4二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7三、论文亩f r 言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·8刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0讨{ 念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 9结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3l四、本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 2五、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘3 3六、附录综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“3 5在学期间科研成绩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 3致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 4个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 5·中文论著摘要·N K 4 慢病毒载体的构建及对人肝癌细胞的生物学特性的影响目的根据肝细胞生长因子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r , H G F ) 在肿瘤发生进展过程中的促进作用和N K 4 对H G F 的拮抗作用，构建共表达人N K 4 基因和增强型绿色荧光蛋白( E G F P ) 基因的重组慢病毒载体，转染人高侵袭转移肝细胞肝癌( H e p a t o c e l l u l a rC a r c i n o m a , H C C ) 细胞L M 3 ，观察其转染效率及表达情况。

研究N K 4 高表达后，H C C L M 3 细胞增殖、凋亡的改变，及对细胞侵袭能力的影响方法采用聚合酶链反应( P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R ) 从H G Fe D N A 中克隆N K 4基因，并经测序鉴定将N K 4 基因与带E G F P 的慢病毒表达载体p L e n t i 6 ．3 ．内部核糖体进入位点序Y I j ( I R E S ) ．E G F P 融合，构建携带N K 4 ／E G F P 双基因的慢病毒表达载体并鉴定利用2 9 3 T 细胞进行慢病毒的包装，将病毒原液浓缩，测定病毒滴度以不同感染复数( M O I ) 的重组慢病毒感染2 9 3 T 细胞，筛选出最适M O I 转染H C C L M 3 细胞，荧光显微镜下观察转染效率W e s t e r nb l o t 法测定细胞中N K 4蛋白表达水平M T T 法测定转染N K 4 后H C C L M 3 细胞增殖能力变化A n n e x i nV ．P E ／7 ．A A D 双染后用流式细胞术分析转染N K 4 对H C C L M 3 细胞凋亡的影响。

通过T r a n s w e l l 法检测转染后H C C L M 3 细胞侵袭能力的变化结果1 、P C R 获得目的基因片段，凝胶电泳观察到约1 3 4 4 b p 的特异条带，经酶切鉴定及测序验证表明N K 4 基因已经成功克隆N K 4 克隆质粒p M D ．1 9 T - N K 4 与载体p l e n t i 6 ．3 ．M S C ．I R E S —E G F P ／V 5 R 进行酶切、连接、转化后，对载体进行酶切鉴定，结果显示在9 3 0 0 b p 附近有一特异性条带，与预期相符合，提示含N K 4 ／E G F P双基因的慢病毒表达载体p L e n t i 6 ．3 - N K 4 ．I R E S 2 ．E G F P 构建成功，并经测序验证比对一致2 、构建的L e n t i 6 ．3 - N K 4 ．I R E S 2 ．E G F P 重组慢病毒表达载体转入2 9 3 T 细胞后4 8 h ，荧光倒置显微镜下可观察细胞有绿色荧光表达，转染效率高达9 0 ％以上L e n t i 6 ．3 ．N K 4 ．I R E S 2 ．E G F P 病毒浓缩后，测得病毒的滴度为：1 ．0 5 ×1 0 8 T U ／m l 。

实验筛选出的最适M O I = 7 ，转染H C C L M 3 细胞后，携带N K 4 基因的H C C L M 3 细胞N K 4 高表达W e s t e r nb l o t 检测发现，稳定转染N K 4 基因的H C C L M 3 细胞能够自分泌分子量约5 0 K D 的N K 4 蛋白3 、M T T 法测得H C C L M 3 ／N K 4 转染组、H C C L M 3 ／空载体组和H C C L M 3 对照组在各个时间点的细胞增殖情况显示，各时间点( 除2 4 h 外) ，N K 4 转染组细胞生长明显减少，与空载体组、对照组相比有显著性差异( 尸 0 ．0 5 ) 4 、流式细胞仪分检测N K 4 组、空载体组和对照组细胞凋亡，N K 4 转染组细胞凋亡明显增加，凋亡率为2 7 ．6 9 - a ：2 ．2 1 ％，与空载体组( 7 ．2 4 + 0 ．1 8 ％) 和对照组( 6 ．5 1 + 0 ．2 3 ％) 相比，差异有统计学意义( 尸 O ．0 5 ) 说明N K 4 可以显著抑匍J H G F 诱导的H C C L M 3 细胞侵袭作用结论l 、成功构建含有N K 4 基因的慢病毒表达载体p L e m i 6 ．3 - N l “．I R E S 2 ．E G F P 质粒。

经测序鉴定及酶切鉴定结果与预期相符，为N K 4 基因的体外实验研究提供基础2 、用最适M O I 转染H C C L M 3 细胞后，筛选阳性克隆后进行指标检测，稳定转染N K 4 基因的H C C L M 3 细胞可以自分泌N K 4 蛋白23·英文论著摘要·T h ec o n s t r u c t i o no fN K 4r e c o m b i n a n tl e n t i v i r a lv e c t o ra n dt h ee f f e c to nt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fn U m a i ih e p a t o c a r c i n o m ac e l l■一●- _O b je c t i v eH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ( H G F ) p l a y sac r u c i a lr o l ei nt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fc a n c e r , a n dN K 4c a l la n t a g o n i z et h ee f f e c to fH G F ．T oe x p l o r et h ee f f e c to fN K 4o nH C C —L M 3 ，w ec o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tl e n t i v i r a lv e c t o rc o e x p r e s s e dN K 4g e n ea n de n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( E G F P ) g e n e ，a n dt r a n s f e c t e dh u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ac e l ll i n e sL M 3w i t hh i 曲i n v a s i o nc a p a b i l i t y ．T r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c ya n dN K 4e x p r e s s i o nw e r ed e t e c t e d ．T h ec h a n g e so fc e l lp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i su n d e rh i g he x p r e s s i o no fN K 4w e r em e a s u r e d ．W h a t ’Sm o r e ，t h ee f f e c to fh i 曲l e v e lN K 4o nc e l li n v a s i o nw a so b s e r v e d ．M e t h o d sN K 4g e n ew a sc l o n e df r o mH G Fc D N Ab yP o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n di d e n t i f i e db yg e n es e q u e n c i n g ．T h eN K 4g e n ew a sc l o n e dt Ol e n t i v i r a le x p r e s s i o nv e c t o rw i t hE G F P [ p L e n t i 6 ．3 一I R E S —E G F P l b yr e c o m b i n i n gD N At e c h n o l o g y ．T h e2 9 3 Tc e l l sw e r ec o t r a n 。