牛结核γ-干扰素ELISPOT检测方法建立.docx

    牛结核γ-干扰素ELISPOT检测方法建立    Summary：研究通过制备牛外周血单核细胞，并对检测技术各因素优化和准确性进行验证，建立了牛结核γ-干扰素ELISPOT检测方法，同时形成该平台相应的操作规范结果表明，在细胞数量为1.25×10个，牛单核细胞培养时间24h，植物血凝素的浓度为200μg/mL的条件下，该牛结核γ-干扰素ELISPOT检测体系较为稳定，为后续研究者基于ELISPOT技术建立更多稳定的检测体系提供了重要理论依据Key：ELISPOT;牛结核病&γ干扰素：S858.28 ：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.0040 引言牛结核病是一种人畜共患病，它主要是由于结核分枝杆菌或者牛分枝杆菌引起的，此疾病对公共卫生安全产生了严重的危害，同时也阻碍畜牧业的生产和发展，目前牛结核病已经被国家列为二类动物疫病此疾病的传染源包括带菌人体和病畜，对于人畜的危害方式主要是通过呼吸道和消化道的感染，细菌进入健康人畜身体后即可发生感染现象，成年牛通常是因为与病牛、病人的直接接触感染此病，犊牛较多是因为食用病牛奶感染1 ELISPOT技术介绍免疫学检测手段具有较好的前景，其中结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）是20世纪快速检测活动性以及潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的唯一手段[14]。

TST应用很广泛，它出现至今已有100多年，其特异性较差和敏感性较高，因此检测结果具有高假阳性率近年随着γ-干扰素释放试验（interferon gamma releaseassay，IGRA）的出现和不断发展，逐渐已被运用在结核病的诊断，该试验涉及到了酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT），此方法有良好检测特性，是结核病诊断的一种新手段ELISPOT是一种细胞免疫学检测方法，它是在单细胞水平上，基于高通量检测机体分泌的抗体或细胞因子，进而得到检测的结果，它是属于ELISA检测技术的一种延伸利用特定酶的显色反应，通过抗体分泌的固定细胞因子，使对应位点产生清晰斑点，进而通过显微镜观察，利用人工计数斑点或着ELISPOT分析仪对结果进行计数2 材料与方法2.1 试验动物进行牛外周血单个核细胞分离制备的健康奶牛选择于上海奶牛研究所实验牧场进行牛结核病检测的32头试验用奶牛血取自上海地区某奶牛场2.2 牛外周血单核细胞制备无菌采取5mL健康奶牛尾静脉血加入含肝素钠的采血管，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血将2mL抗凝血与灭菌PBS1：1稀释后，再将4mL稀释牛血缓缓加入含3mL牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下400g离心20min，可见外周血单个核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至干净的离心管中，加入灭菌PBS，将细胞混匀后，于室温200g离心10min，重复2次。

弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μL细胞悬液加入细胞计数仪下进行计数2.3 牛结核γ-扰素ELISPOT检测方法建立2.3.1 ELISPOT操作步骤的确定使用包被液稀释的捕获抗体MT17.1加入96孔滤膜板，100μL/孔，4℃无菌过夜包被;弃包被液，使用含有灭菌PBS洗板4次;加入含10%胎牛血清的完全1640培养基，200μL/孔，室温孵育封闭30min;弃封闭液，使用PBS洗板1次，将96孔滤膜板直接用于检测或置4℃保存在上述包被的96孔滤膜板中加入50μL刺激原，并设立对照组，然后每孔加入50μL牛外周血淋巴细胞悬液，将96孔滤膜板置于37℃、5% CO2培养箱培养12～48h;将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBS洗板5次，5min/次，洗板后甩干加入用0.5%胎牛血清的PBS稀釋的牛γ干扰素检测抗体MT307-biotin，100μL/孔，置于室温孵育2h;用PBS洗板5次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物，100μL/孔，置于37℃孵育1h;每孔加入100μL底物液TMB，放置于室温避光显色在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下晾干;将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描计数和分析。

2.3.2 ELISPOT方法的判定标准的建立本研究中中牛结核γ干扰素曰，ISP07方法的判定标准：若牛型PPD刺激孔中斑点数减去PBS对照孔中的斑点数以及牛型PPD刺激孔中斑点数减去禽型PPD刺激孔中斑点数都大于或等于6个，则可以判定为阳性;若牛型PPD刺激孔中斑点数减去PBS对照孔中的斑点数或牛型PPD刺激孔中斑点数减去禽型PPD刺激孔中斑点数小于6个，则可以判定为阴性2.3.3 最佳细胞数量的确定将细胞数用RPMI-1640培养基稀释，每孔加入100μL，含细胞数量分别为1.25×10/孔、2.5×10/孔、1.25×10孔，将96孔滤膜板置于37℃、5%CO培养箱培养16h其他步骤均按照2.3.1中操作程序2.3.4 牛单核细胞培养时间优化将3块培养板放在37℃、5% CO培养箱中，反应时间分别为12、24，48h，试验操作步骤参照2.3.1进行2.3.5 植物血凝素浓度优化将植物血凝素的浓度分别用无菌PBS液稀释至200、20、2μg/mL，试验操作步骤参照2.3.1进行2.4 ELISPOT和ELISA技术同步检测牛结核病无菌采集32份奶牛尾静脉血，将抗凝血加入到24孔细胞培养板，每头牛抗凝血分装3孔，1.5mL/孔，各孔分别加入相应的刺激原100μL（PBS、Avian PPD、Bovine PPD），充分混匀，CO培养箱中孵育24h，吸取200μL上层血浆作为待检样品用于牛结核外周血IFN-γ释放试验的检测，参照BOVIGAMTM Mycobacterium bovisGammaInterferon Test Kit for cattle说明书进行。

在96孔滤膜板中分别加入2.5μg/mL的捕获牛γ干扰素抗体MT17.1，100μL/孔，4℃过夜包被弃包被液，进行洗涤和封闭后备用对上述奶牛场30头奶牛分别无菌采取3mL尾静脉血加入含肝素钠的抗凝管，进行牛外周血单个核细胞的制备和计数在上述包被的96孔滤膜板中分别加入50μL培养液至每个对照孔、50μL10μg/mL的禽型PPD、50μL10μg/mL的牛型PPD至每个检测孔分别加入50μL每头牛的外周血单个核细胞悬液至培养液对照孔、禽型PPD和牛型PPD检测孔，将96孔滤膜板置于37℃、5% COz培养箱培养24h;将96孔滤膜板取出，弃培养上清，使用PBS洗板5次，5min/次，洗板后甩干加入用0.5%胎牛血清的PBS稀释的牛γ-干扰素检测抗体MT307-biotin（0.25μg/mL），100μL/孔，置于室温孵育2h;用PBS洗板5次，洗板后甩干，加入1：1000稀释的亲和素-辣根过氧化物酶结合物，100μL/孔 ，置于37℃孵育1h;每孔加入100μL底物液TMB，放置于室温避光显色在96孔滤膜板中加入纯净水终止反应，去除液体，室温下晾干;将96孔滤膜板放入ELISPOT仪中，对实验结果进行扫描計数和分析。

3 结果3.1 最佳细胞数量确定结果将细胞数用RPMI-1640培养基稀释，每孔加入50μL培养基与50μL牛外周血单个核细胞悬液[1]，含细胞数量分别为1.25×10/孔、2.5×10/孔、1.25×10孔将96孔滤膜板置于37℃、5%CO培养箱培养16h其他步骤均按照2.3.1中操作程序结果所得斑点数分别为69、116、142，见图1、表1，随着细胞数量增加斑点数也明显增多1.25×10孔形成的斑点数目过多，背景连片无法区分特异性与非特异性斑点，故选用1.25×10孔的细胞数量3.2 牛单核细胞培养时间优化结果将3块培养板放在37℃、5% CO2培养箱中，反应时间分别为12、24、48h，试验操作步骤参照2.3.1进行结果分别为112、175、232，见图2、表2，结果孵育24h效果最佳，斑点清晰，形态良好[2]3.3 植物血凝素浓度优化结果将植物血凝素的浓度分别用无菌PBS液稀释至200、20、2μg/mL，试验操作步骤参照2.3.1进行结果分别为270、54、24，见表3，选用200μg/mL作为试验最佳浓度3.4 ELISPOT和ELISA技术同步检测牛结核病结果ELISPOT方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒同步检测牛结核病，并对所得到结果进行比较如下。

4 讨论酶联免疫斑点检测技术是近年发展起来，它是一种基于检测细胞因子的免疫学方法ELISPOT方法是将ELISA技术与细胞培养结合，而构建的一种新型检测技术，它是在单细胞培养水平上，体外检测特异性抗体分泌细胞此项技术可以对细胞因子分泌量进行快速和便捷的定量，目前在免疫学抗原特异性T细胞领域的研究中，已成为国际公认的一项主流免疫学检测技术同时，ELISPOT检测技术也会在动物研究领域发挥重要作用，具有广泛的应用前景[3]但该技术还未形成标准化程序，对细胞数量、浓度和培养时间等条件的优化还未构成完整的体系因此，在检测研究实践中，通过对检测技术各因素优化和准确性进行验证，并总结操作过程的注意事项，为后续研究者建立稳定的ELISPOT检测体系提供一定的理论依据5 结论本研究通过制备牛外周血单核细胞，进一步优化最佳细胞数量、牛单核细胞培养时间和植物血凝素的浓度，从而建立了牛结核γ-干扰素ELISPOT检测体系运用ELISPOT技术和ELISA试剂盒对此检测体系进行评价，并形成了该检测平台相应的操作规范（SOP）结果显示，当细胞数量为1.25×10，牛单核细胞培养时间24h，植物血凝素的浓度为200μg/mL的条件下，该ELISPOT检测体系较为稳定，这为后续研究者进行牛结核疾病的检测奠定了科学的理沦基础。

Reference[1]万康林.中国结核病流行新特点及挑战[J].疾病监测.2008，23（I1）：667-670.[2]潘福宝，袁晓娟.牛结核病的研究概况[J].今日畜牧兽医，2019，35（4）：74.[3]李正波.牛结核病的诊断与防治[J].农村百事通，2018（21）：29-30.  -全文完-。