重组蛋白的表达系统详细ppt资料课件.pptx

重组蛋白的表达系统详细一、 原核表达系统原核表达系统发展完善、流程简单快速、成本低、产量高，对大部分蛋白来说都值得一试，尤其适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白1.1 表达菌株表达菌株原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等其中革兰式阳性的Bacillus更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异源蛋白大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统常用大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3DE3是的一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录同时，还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的大肠杆菌表达菌株。

表2 常用E. coli表达菌株1.2 质粒载体质粒载体大肠杆菌表达系统采用质粒为表达载体，质粒上的重要元件包括复制子，启动子，终止子，多克隆位点，信号肽，融合标签，筛选标记等（图1）原核表达载体已经发展得比较完善，有多种质粒可供选择(表4)复制子：复制子决定着质粒载体在宿主中的拷贝数通常情况下质粒拷贝数越高，重组蛋白的表达量就越高，但是高拷贝的质粒也会严重影响宿主的生长，质粒本身也不稳定，容易丢失和突变克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子，如pSC101；表达载体通常选用高拷贝的复制子，如pCoE1，pMBI（pUC），等如果需要进行多个质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101和pUC共表达检查重组蛋白序列，分泌表达时需要糖基化位点Asn-X-Ser/Thr真核表达系统常采用穿梭质粒为表达载体如果需要多拷贝的外源基因，可以使用带有HIS4基因的载体，并选择HIS4中的酶切位点进行线性化原核系统中，常见的筛选标记有蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选和抗生素筛选，也可以将几种筛选手段混合起来使用P10蛋白也是病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。

某些载体允许构建多个串联的外源基因表达盒，以弥补整合型载体拷贝数量的缺陷除表达盒之外，载体上还有筛选标记（营养缺陷互补基因、抗生素抗性基因）和在细菌中进行拷贝增殖所必须的序列（启动子、终止子、复制子、抗生素抗性基因等）而且糖链中和糖链末端都没有1,3-甘露糖，对重组蛋白抗原性的影响也比酿酒酵母低pOG44带有编码了Flp重组酶的基因，将其与表达载体共转染，Flp重组酶帮助表达盒插入宿主染色体的FRT位点，即可获得稳定表达重组蛋白的细胞株其中，tetO的连续7个拷贝和最小化的CMV启动子组成了Tet应答启动子hCMV*-1，当调控蛋白（tTA或rtTA）结合在启动子上时，下游的外源基因得到转录食用转基因植物进行免疫接种时考虑植物中是否存在一些会影响免疫效果的物质如果需要进行多个质粒的共转化，就要根据复制子的相容性选用不同复制系统的复制子，如pSC101和pUC共表达克隆载体上一般有多个线性化酶切位点供选与酿酒酵母相同，毕赤酵母也可以进行二硫键形成、磷酸化、乙酰化、糖基化等翻译后修饰，也只能利用甘露糖残基对蛋白进行糖基化修饰在重组蛋白N端加入信号肽，将其引导至周质空间，用跨膜过程来帮助蛋白折叠和二硫键形成，并减轻蛋白降解；启动子：表达重组蛋白时，我们需要考虑启动子的强弱、作用方式、调控方式和本底表达水平。

表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等按照作用方式，启动子可以分为两类：组成型表达的启动子使宿主不停地表达重组蛋白，常用于工业生产，如S等；诱导型表达的启动子使宿主仅在受到诱导（诱导剂、温度等）时表达目的蛋白，诱导型启动子使重组蛋白的表达容易控制，同时降低了外源蛋白对细菌生长的影响图1：大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱及多克隆位点早期大肠杆菌表达体系中，常见的启动子是lac和lacUV5lac是一个弱启动子，很难使外源基因得到高表达目前使用的含有需要小量共表达的蛋白(如分子伴侣，蛋白抑制剂等)的载体，有很多都采用了经典的lac启动子强启动子中，tac和trc是lac启动子的变体，其重组蛋白产率能够达到细胞总蛋白量的15-30%araBAD启动子的诱导剂是便宜无毒的L-阿拉伯糖，本底表达量低，启动能力比tac稍弱T7则是目前原核表达系统中最高效的启动子，pET表达系统即是以它为中心构建的T7启动子来源于噬菌体，专一与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶则被整合在宿主菌的基因组中在噬菌体溶源的表达宿主菌，如BL21（DE3）中，lacI抑制T7 RNA聚合酶的表达，IPTG的加入可以解除这种抑制。

当受到诱导时，T7 RNA聚合酶开始表达并结合在T7启动子上，启动重组蛋白的表达T7 RNA聚合酶活性很高，转录速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，使其下游的重组蛋白得到高效表达，其产率可以达到细菌总蛋白量的50%以上T7lac启动子则在T7启动子下游加入了一个lac操纵子，其中带有一个常规启动子和lac阻遏蛋白的编码序列lac阻遏蛋白可以抑制宿主合成T7 RNA聚合酶，并阻断T7 RNA聚合酶导致的目的基因转录，从而降低重组蛋白的本底表达水平PL、cspA启动子使宿主菌能够进行温度依赖型的表达在温度敏感型突变体菌株中，PL等启动子使得宿主在30时抑制重组蛋白表达，而在42 时诱导重组蛋白表达；cspA启动子则被高温（37）抑制，低温（10）启动温度诱导型的启动子避免了诱导剂的引入，降低了使用成本，同时也降低了诱导剂对细胞的伤害终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。

启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。

翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。

表3：常用融合标签筛选标记：在没有压力的环境下培养时，细菌中的外源质粒常常随着细胞复制而丢失为了稳定质粒、表达重组蛋白，需要在载体中加入筛选标记，使宿主菌在原则压力下生长原核系统中，常见的筛选标记有蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选和抗生素筛选，也可以将几种筛选手段混合起来使用常见的抗生素筛选标记有：青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等氨苄青霉素由于会被抗性细菌分泌的-内酰胺酶和酸性环境破坏掉，其筛选效果会随时间降低，不适宜连续发酵，将抗性基因反转或换用对低pH不敏感的羧苄青霉素可以部分解决这个问题；卡那霉素不会被破坏，抗性较强，但是不同菌株的抗性差异较大，平板培养和悬浮培养液有所不同，使用时常需要针对个别菌株摸索适宜浓度；氯霉素抗性常见于有特殊用途的菌株和质粒，如pLysS抗生素浓度的过高或过低都会降低重组蛋白的表达量，另外在使用多个载体进行共表达时，应注意不同的质粒要携带不同的筛选标记，抗生素浓度也要比单独表达适当降低分泌表达：如果不希望重组蛋白表达在细胞质中，可以在重组蛋白的N端加入信号肽，引导蛋白穿越细胞膜大肠杆菌的分泌表达一般是分泌到周质空间，各种芽孢杆菌则可以分泌到培养基中，简化纯化流程。

分泌表达的表达量通常远远低于胞质表达，但是也有其优势：跨膜过程可以帮助重组蛋白折叠，提高其溶解性和活性；周至空间和培养基的氧化环境能够帮助二硫键形成；也可用于除去牢固结合在蛋白上的配体；分泌到细胞外还能降低有毒重组蛋白对细胞的影响表4：常用原核表达载体质粒1.3 优化表达条件优化表达条件重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和流程的优化是必须的当重组蛋白不表达时：如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统当表达量不理想时：检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变将这些稀有密码子（尤其是N端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平，必要时可以根据宿主的偏好重新合成cDNA。