实验一：米氏常数的测定1900字.docx

    实验一米氏常数的测定1900字    生化分析实验一 实验日期： 年 月 日双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】19xx年，Michaelis和Menten运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：v?Vmax??S? 式中：v为反应初速率（微摩尔浓度变化/min）；Vmax为最大反应速率（微摩Km?S尔浓度变化/min）；?S?为底物浓度（mol/L）；Km为米氏常数（mol/L）这个方程式表明当已知Km及Vmax时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系Km值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一不同酶的Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km越大表明亲和力越小；Km越小表明亲和力越大。

大多数纯酶的Km值在0.01?100 mmol/L通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：1Km111111????以对作图得一直线，该直线与横轴截距? vVmaxSVmaxSKmvS过氧化物酶是一种对氢受体（H2O2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase, HRP）HRP属于含血红素蛋白的一种，是由辅基——氯化血红素（铁卟啉）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000HRP是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的Km，通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应来处理本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）作为氢受体，它可被Hb催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（?max=650 nm）。

实验中我们使TMB的浓度大过量，测定HRP对H2O2的Km值（反之亦可测定HRP对TMB的Km值）实验仪器及试剂】仪器：日立 UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色皿（1 cm）：2只；100 ?L微量取样器1支（枪头若干）；1 mL取液器一支；电磁搅拌器1台（1 cm聚四氟乙烯搅拌子1个 ）试剂：过氧化物酶（HRP溶液： mol/L；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB）： mol/L（DMSO溶液）；H2O2溶液： mol/L；磷酸缓冲液（PBS）：pH= ； mol/L 1生化分析实验一 实验日期： 年 月 日【实验步骤】在1 cm的比色皿（内置搅拌子）中加入1.7 mL PBS，然后在搅拌下，依次加入100 ?L HRP、TMB和不同量的H2O2溶液，马上移入样品架，记录650 nm处吸收峰强度随时间变化的曲线参比：1.7 mL PBS+100 ?L HRP+100 ?L TMB）【数据记录与处理】温度：______【注意事项】 H2O2应该配置成不同浓度，加入相同体积为佳，但是由于动力学测定本身误差较大，且H2O2本身体积所占比例不大，故采取上述步骤思考题】1. 可查阅天然的过氧化物酶对H2O2的Km并与测定值进行比较2. 初速率的测定应注意什么问题？本实验中初速率的单位为A（吸光度）/s（秒）与米氏方程中的单位并不相同，为什么不影响km的测定？如需测定Vmax，应如何进行？2第二篇：实验1胰蛋白酶的米氏常数测定 500字试验号（酶解时间/min) 2min 4min 6min 8min 11.4g/L 2.00 2.25 2.43 2.55 15.0g/L 4.10 4.45 4.65 4.75 21.0g/L 4.90 5.05 5.40(舍） 5.90酪蛋白浓度 1/ [s] 初速度 1/v0 [s] /v011.4 0.0877 9.15 0.1090 1.24215.0 0.0667 10.75 0.0930 1.39521.0 0.0476 17.32 0.0577 1.212＋   -全文完-。