分子生物学实验操作方法与技巧（5）课件.ppt

分子生物学与生物化学实验分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能操作、设计与技能转化技术转化技术( (一一) ) 李刚 副教授分子生物学实验操作方法与技巧（5）contents    酵母转化技术2细菌转化技术1分子生物学实验操作方法与技巧（5）细菌转化技术•一、化学转化法；•CaCl2转化法、CaCl2-MgCl2转化法、Hanahan方法、Inoue方法等；•二、物理转化法： 电击转化法、基因枪转化法等；超声波转化法、激光转化法等；分子生物学实验操作方法与技巧（5）化学转化法概述•用简单的盐溶液（如用简单的盐溶液（如CaClCaCl2 2等）处理大肠杆菌细胞，使其细胞膜的通透等）处理大肠杆菌细胞，使其细胞膜的通透性发生了暂时性的改变性发生了暂时性的改变, ,成为能允许外源成为能允许外源DNADNA分子进入的感受态细胞分子进入的感受态细胞(Competent cells)(Competent cells)这种转化外源这种转化外源DNADNA的方法称为化学法的方法称为化学法现在大部分应用于细菌转化的化学方法都基于Mandel和Higa的实验结果，他们发现细菌用冰冷的CaCl2处理后，在37˚C或42˚C加热能够被噬菌体DNA转染。

同样的方法随后也被应用于以质粒DNA和大肠杆菌染色体DNA转化细菌对于每微克超螺旋DNA，这种简单而有效的方法通常能产生这种简单而有效的方法通常能产生10105 5和和10106 6个大肠杆菌的转化克隆个大肠杆菌的转化克隆，这种转化效率对于很多常规的工作如质粒转化或载体的构建已经足够了然而当可能得到的每一个克隆都相当重要时，例如，构建cDNA文库或只有很少的目的外源DNA可以利用时，较高的转化效率是必需的通过对最初的CaCl2转化方法的一系列改良，现在的化学转化方法由每微克超螺旋质粒现在的化学转化方法由每微克超螺旋质粒DNADNA通常可获得通常可获得数量为数量为10106 6-10-109 9的转化子的转化子，实验方法的改进使转化效率不再是分子克隆中的一个限制因素而被取消了化学转化法简便易行,不需要特殊的试剂和仪器，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的制备出的感受态细胞暂时不用时感受态细胞暂时不用时, ,可加入占总体积可加入占总体积1515％的无菌甘油于％的无菌甘油于-70℃-70℃保存保存( (可保存半年而转化效率没有明显的下降可保存半年而转化效率没有明显的下降),),因此目前化学转化法是分子生物学实验室使用最广泛的一种转化方法。

 分子生物学实验操作方法与技巧（5）最经典、最可靠的化学转化法：CaCl2法•CaClCaCl2 2转化法的效率：转化法的效率：•5 5  10106 6  -2 -2  10107 7个转化克隆／g超螺旋质粒DNA•改良的CaCl2转化法（个人方法）：•转化效率介于10107 7－－10108 8左右，比传统的氯化钙法高10－100倍类似于分子克隆第三版上的CaCl2转化法，但有些区别有些区别•CaCl2转化法优点：•重复性好，对操作技术要求不高，对DNA纯度、试剂质量要求不高（但是熟练而细心的操作、纯的DNA样品和高质量的试剂仍然能获得最好的结果）；•CaCl2转化法缺点：•转化效率不高，一般仅用于载体构建，不用于建库分子生物学实验操作方法与技巧（5）Preparation of Calcium-competent Bacteria Cells•Put 2 ml of O/N bacteria culture into 200 ml LB（tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%, pH7.0）•Incubate at 370C until OD550=0.5•Chill on ice-water bath, swirl•Spin at 5,000rpm for 10 min•Re-suspend in 100 ml ice-cold Mg++ solution (100mm MgCl2/10mM Tris.Cl, pH7.5)• On ice-water bath for 5 min• Spin at 4000rpm for 10 min• Re-suspended in 100 ml of ice-cold Ca++ solution (100 mM CaCl2/10 mM Tris.Cl, pH 7.5)•On ice-water bath for 20 min• Spin at 4000rpm for 10 min• Re-suspend in 10 ml Ca/Glycerol (8.5 ml Ca++ solution/1.5ml glycerol)• Aliquot to 200 ul/tube, store at -700C freezer分子生物学实验操作方法与技巧（5）Solutions:•1. Mg++ solution:2. Ca++ solution:• •1M MgCl2       12 ml1M CaCl2 15 ml     1M Tris, pH 7.5   1.2 ml 1M Tris, pH 7.5   1.5 ml• H2O up to 120 ml                                       H2O   up to 150 ml• • •3. Ca++ glycerol:• •42.5 ml Ca++ solution + 7.5ml Glycerol 分子生物学实验操作方法与技巧（5）Calcium-mediated Transformation of Bacteria    •To 50-100 ul competent bacteria cells add 1-5 ul of DNA ligation reaction or plasmid DNA, mix by tapping gently •Stand on ice for 30 min  •Put into 420C water bath for 30 sec. •Add 250 ul to 500 ul of pre-warmed SOC (or LB)• •Shake the vials or tubes at 370C for 45 min to 1 hour at 225 rpm• •Spread 20 ul to 200 ul transformed bacteria onto bacteria agar plates (you may also dilute the bacteria before spreading)•Invert plates, and put into incubater at 370C, over night. 分子生物学实验操作方法与技巧（5）SOC 培养基的配制•SOB培养基的配制:•配制每升培养基,在950 ml 去离子水中加入：•胰化蛋白胨（tryptone）20 g•酵母提取物 5g•NaCl 0.5g•摇动容器使溶质完全溶解。

加10 ml 250 mM KCl 溶液（将1.86g KCl用100 ml 去离子水溶解即配成250 mM KCl溶液）用5 M NaOH调pH值至7.0用去离子水定容至1L在15 psi（1.05kg/cm2）高压下蒸汽灭菌20 min. 该溶液在使用前，加入 5 ml灭菌的2 M MgCl2 [2 M MgCl2 溶液的配制方法如下：用90ml去离子水溶解19 g MgCl2, 用去离子水调整体积为100 ml,在15 psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20 min]•SOC培养基：•SOC培养基除含有 20 mM葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同SOBSOB培养基经高培养基经高压灭菌后冷至压灭菌后冷至6060 C C或或6060 C C以下，加以下，加20ml20ml除菌的除菌的1 M1 M葡萄糖溶液葡萄糖溶液（1M 葡萄糖溶液的配制方法是： 用90 ml 去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后， 用去离子水定容至100 ml，用0.22 m滤器过滤除菌）•SOCSOC培养基极易染菌，所以配好后一定要分装成小份，每次取一份使用，其余放培养基极易染菌，所以配好后一定要分装成小份，每次取一份使用，其余放4°C4°C保存。

保存分子生物学实验操作方法与技巧（5）CaCl2转化法获得高转化效率的关键•1、制备感受态所用的水最好用超纯水超纯水，尽可能使用新买的生化试剂新买的生化试剂配制培养基、化学溶液和制备感受态如果可能，最好用国外的原装试剂原装试剂来配制培养基和化学溶液•2、本方法中的CaClCaCl2 2应该用应该用CaClCaCl2 2·2H2H2 20,MgCl0,MgCl2 2应该用应该用MgClMgCl2 2·6H6H2 2O,O,这样可获得最佳的转化结果另外CaClCaCl2 2和和MgClMgCl2 2最好都用国外产的试剂最好都用国外产的试剂，以保证最佳转化效率•3、细菌的生长状态：由于未知的原因，最高的转化效率总是用直接取自最高的转化效率总是用直接取自冻存于冻存于-70-70 C C的储备液中直接培养获得的，的储备液中直接培养获得的，因此，不应使用在实验室中连续传代或存放于4 C或室温的培养物•4、玻璃和塑料器皿的清洁玻璃和塑料器皿的清洁 微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅度地降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的的玻璃容器其他目的的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（MiniMini－－Q Q水或相当的水）充满水或相当的水）充满，再经高温高压消毒。

水在玻璃器皿使用前应倒掉分子生物学实验操作方法与技巧（5）Hanahan转化法•20世纪70年代晚期和80年代早期，Dong Hanahan在冷泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前从未听说过的转化效率，并且以后他的方法被标准化了, 称为Hanahan转化法•如果足够细心，用如果足够细心，用HanahanHanahan的方法可获得高达的方法可获得高达5X105X108 8的转化效率的转化效率可事实上只有少数人能够重复出Hanahan本人的高转化效率•由于该方法对操起技巧和细心程度要求较高，重复性低，这里不做介绍有兴趣的同学可参考分子克隆上的步骤进行尝试分子生物学实验操作方法与技巧（5）Hanahan方法获得高转化效率的关键因素•1、使用高纯度的水和二甲基亚砜使用高纯度的水和二甲基亚砜，实验过程中尽可能使用新买的试剂和培养基新买的试剂和培养基•2、细菌的生长状态接种的细菌应用直接接种的细菌应用直接取自冻存于取自冻存于-70℃-70℃的储备菌中直接培养获得的储备菌中直接培养获得而不能使用在实验室中连续传代或存放于4 ℃或室温的培养物•3、试验中所使用的玻璃和塑料器皿应清洗试验中所使用的玻璃和塑料器皿应清洗干净，并用超纯水充满干净，并用超纯水充满，再经高温高压消毒。

分子生物学实验操作方法与技巧（5）Inoue方法制备超级感受态方法•用化学方法制备超级感受态的方法主要有：HanahanHanahan的方法和的方法和InoueInoue的方的方法•采用HanahanHanahan的方法一般可以达到的方法一般可以达到5 5  10108 8个个转化克隆转化克隆／g超螺旋质粒DNA，而采用InoueInoue的方法一般可以达到的方法一般可以达到1 1  10108 8  -3 -3  10108 8个转化克隆个转化克隆／g超螺旋质粒DNA•与上一种制备超级感受态的Hanahan的方法相比，InoueInoue方法的优点在于方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好这一方法与其他方法有所不同并不过分地讲究细节，但是重复性更好这一方法与其他方法有所不同的是细菌在的是细菌在18 18 0 0C C进行培养而不是通常的进行培养而不是通常的3737 0 0C C否则这个方法就没有什么特别之处没人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率也许是18 0C时合成的菌膜成份和物理性状更有利于获取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。

•在在1818 0 0C C进行细菌培养并非易事进行细菌培养并非易事，大多数实验室都没有这种摇床将摇床将摇床置于置于4 4 0 0C C冷室，用温控器加温至冷室，用温控器加温至1818 0 0C C是一个解决问题的方法也可使培是一个解决问题的方法也可使培养物的温度维持在养物的温度维持在2020－－2323 0 0C C，这样做并不会造成转化效率降低这样做并不会造成转化效率降低这一温度在很多实验室其实是室温在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5-4h如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时侯，这时细菌的细菌的ODOD600600 吸收值似乎永远不能达到理想的吸收值似乎永远不能达到理想的0.60.6解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌分子生物学实验操作方法与技巧（5）本方法需要的缓冲液和溶液•二甲基亚砜（DMSO）•二甲基亚砜的氧化产物是转化的抑制物，为避免上述问题，应购买高质量的高质量的DMSODMSO•Inoue转化缓冲液（见后面）•用前置于冰上预冷至0C•培养基：LB，SOB，SOC。

•专用设备：•液氮•18 C 摇床•42 C恒温水浴分子生物学实验操作方法与技巧（5）操作步骤•1.制备Inoue转化缓冲液（用前冰上预冷用超纯水（用超纯水（MilliMilli－－Q Q过滤水）配制过滤水）配制•A. 0.5M PIPES PIPES (pH6.7)[哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)]溶液的配制:将15.1g PIPES 溶于80ml超纯水中,用5 M KOH调pH值至6.7，最后加纯水，定容至100ml用预先处理的用预先处理的NalgeneNalgene滤膜滤膜(0.45(0.45 m m孔径孔径) )过滤除菌分成小份于－过滤除菌分成小份于－2020 0 0C C保存•B. Inoue转化缓冲液的配制:将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml 0.5 M 的PIPES （pH6.7），加纯水定容至1L•试剂 需要量／L 终浓度•MnCl2.4H2O 10.88g 55 mM•CaCl2.2H2O 2.20g 15mM•KCl 18.65g 250mM•PIPES (0.5M, pH6.7) 20 ml 10mM•H2O 补至1L•C. 用预先处理的NalgeneNalgene滤膜（滤膜（ 0.450.45 m m孔径孔径）过滤除菌）过滤除菌，分成小份于－20 C 保存。

分子生物学实验操作方法与技巧（5）操作步骤（续）•2. 挑取一个经37  C 培养16－20h平面上的单菌落（2－3mm直径），接种至250mL 锥形瓶中的25 ml LB 培养液或SOB 培养液中，37  C 摇床（250－300r/min）培养6－8h•3. 晚上约6点，将上述初始培养物接种于三个三个盛有250ml SOB 培养液的1L 锥形瓶中，第一个加第一个加10mL,10mL,第二个加第二个加4ml,4ml,第三个加第三个加2ml,2ml,于于1818－－22 22   C C 中速摇床过夜中速摇床过夜•4.4.次日早上次日早上, ,测量三瓶培养物的测量三瓶培养物的OD600OD600值，每值，每45min45min测定一次测定一次•5. 5. 当有一瓶的培养物当有一瓶的培养物OD600OD600＝＝0.550.55时，将培养瓶置于冰上时，将培养瓶置于冰上10min10min，弃去另两瓶培，弃去另两瓶培养物•6. 于4  C 以 2500g(相当于Sorall GSA 转头，3900r/min)离心10 min收集菌体•7. 倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min 以吸干剩余液体，用一个真空吸引器将贴附在管壁上的培养基吸干。

•8. 加 80mL 预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀轻轻旋转，不要用振荡器或重悬细菌沉淀轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸•9. 于4  C 2500g 离心10 min 收集菌体•10. 倒去上层培养液， 将离心管倒扣在吸水纸上2 min以吸干剩余液体，用一个真空吸引器将附着在管壁上的培养基吸干分子生物学实验操作方法与技巧（5）冻存感受态细胞•1、用20 ml 预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀•2、加1.5ml DMSO轻轻混匀细菌悬液，放置冰上10 min•3、迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冷冻感受态细胞贮存于－快速冷冻感受态细胞贮存于－70 70   C C 备用•用液氮冷冻可提高转化效率约用液氮冷冻可提高转化效率约5 5倍一般分装成每份50l感受态细胞足够用了，但如果需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每一小份感受态细胞的量可能需要加大些，如100－200 l •4 4、需要时，从－、需要时，从－70 70   C C冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。

细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置化细胞细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10 min10 min•5、用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中，放置在冰浴上不用玻璃管是因为它们会降低转化效率约不用玻璃管是因为它们会降低转化效率约1010倍 分子生物学实验操作方法与技巧（5）转化•一定要做阳性和阴性对照一定要做阳性和阴性对照•1.将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中（50l感受态细胞需要25ngDNA）,体积不应超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物实验中至少设对照管：一个含有感受态细胞和已知量的超螺旋质粒DNA，另一管只有感受态细胞混匀内容物，冰浴30min•2.2.将管放入预加温至将管放入预加温至42 42   C C 的循环水浴中，恰恰放置的循环水浴中，恰恰放置90s,90s,不要摇动不要摇动•热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要•3. 3. 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 1－－2min.2min.•4. 每管加800 l SOC培养基（或LB），用水浴将培养基加温至37  C 的摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

•为最大限度地提高转化率，复苏期中应温和地摇动细胞（复苏期中应温和地摇动细胞（<225r/min<225r/min）•如果带有互补，按以下方案进行•5. 将适当体积 （每个 90mm 平板达200 l ）已转化的感受态细胞转移到含 20 mM MgSO4 和 相应抗生素的SOB培养基上•玻璃涂棒要先在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面•如检查氨苄青霉素抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落）分子生物学实验操作方法与技巧（5）物理转化法•当大肠杆菌暴露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成暂时孔洞，于是DNA分子可由该孔进入细胞这种电击的方法最初是用来诱导DNA进入真核细胞的，随后又被用于质粒转化大肠杆菌和其他细菌这是DNA转化细菌的最简单、最快捷、最有效和重复性最好的方法• 通过优化各种参数包括电场的强度、电脉冲长度，DNA的浓度和电击缓冲液的组成能够获得每微克DNA超过1010个转化子的转化效率对于对于2.6-85kb2.6-85kb的质粒，其转化效率可达到每微克质粒的质粒，其转化效率可达到每微克质粒DNADNA获得获得6×106×101010~-~-1×101×107 7个转化子。

个转化子这比通过化学方法制备的感受态细胞的最高转化效率高10-20倍以上如此高的转化效率对于构建大而高度复杂的如此高的转化效率对于构建大而高度复杂的cDNAcDNA文库尤为有用文库尤为有用电穿孔方法适用于实验室普遍使用的大多数大肠杆菌菌株•当然，电击的简易和效率是有代价的电穿孔法需要昂贵的电击仪和电穿孔法需要昂贵的电击仪和价格不低的电击杯价格不低的电击杯但对于很多研究者而言，该法重复性好，简单易行，是最好的选择•电击杯的使用次数：目前电击杯没有国产商品，进口电击杯35-45元/个，价格昂贵根据我们自己的使用经验和国外文献报道，每个电击，每个电击杯可使用十几次而电击效率基本保持不变杯可使用十几次而电击效率基本保持不变分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation protocol for E.coli DH5(1)•Eppendorf Electroporator 2510, cuvette: 1mm gap width.•Making electrocompetent cells:•1. Inoculate 500 ml LB medium with 2.5 ml of a fresh overnight culture of E. coli DH5. Grow at 37C with shaking to an O. D. 600 of 0.5-0.6.•2. Chill cells on ice for 15 min and transfer to a prechilled centrifuge bottle. Harvest by centrifugation (20 min, 5000g,2-4 C ). Resuspend pellet in 5 ml ice-cold water. Keep the cells cold during the entire procedure.•3. Wash twice with the original culture volume of ice-cold water. Centrifuge as above. Resuspend pellet by swirling in remaining liquid.•4a. If using the cells immediately, place suspension in a prechilled tube and centrifuge (10 minutes, 5000g,2-4 C ).Resuspend the cells in ice-cold water to a final concentration of approximately 2  1011 cells/ml. Aliquote 40-300l cells into prechilled centrifuge tubes.•4b. If freezing the cells for later use, add 40 ml of ice-cold 10% glycerol, mix and centrifuge for 10 min, at 5000g and 2-4 C. Resuspend the cells in ice-cold 10% glycerol to a final concentration of approximately, 2 1011 cells/ml. Aliquote 40-300l cells into prechilled centrifuge tubes.quick freeze on dry ice and store at -80 C .分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation protocol for E.coli DH5(2)•Electroporation of cells:•1. Add 1l DNA (10 pg in water) to tubes containing 40 l  electrocompetent cells. Homogenize by gentle mixing with pipette several times.•2. Transfer mixture to a prechilled cuvette. Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.•3. Electroporation:•Voltage(V)   1700V(2500V)•Time constant () 5ms•4. Immediately add 1ml SOC medium and transfer to a sterile culture tube with a pasteur pipette. Incubate 30-60 min with moderate shaking at 37 C .•5. Plate on LB plates containing the appropriate selection chemical.•Expected results:•Transformation efficiency up to 3  109 transformants/g of DNA.分子生物学实验操作方法与技巧（5）电击-热激法制备超级感受态及转化的操作步骤•本方法适于做本方法适于做E.coli BL21BL21或其他转化效率比较低的细菌的感受态！或其他转化效率比较低的细菌的感受态！•一、感受态的制备：•1、接种250μL（赶时间用500μL） 新鲜的过夜DH5α培养液（DH5α用单菌落接种）到50ml LB培养基中，37˚C剧烈震荡培养至OD600到0.5-0.6（也可取0.55作为最终的OD600值）。

•2、将将50mL50mL培养好的菌液中补加培养好的菌液中补加2.5mL 0.9M2.5mL 0.9M过滤除菌的蔗糖过滤除菌的蔗糖（（SucroseSucrose）溶液，使得菌液中蔗糖溶液的终浓度为）溶液，使得菌液中蔗糖溶液的终浓度为45mM45mM220rpm220rpm，，4 4˚C C培养约培养约4 4个小时•3、 冰上冷却细胞15分钟，然后转到一个预冷的离心管中4˚C，5000g，（或5000rpm）20min离心收获细胞（离心转速不能太大，一离心转速不能太大，一般不要超过般不要超过5000g5000g）•4、 用用0.5ml0.5ml冰冷的超纯水（过滤除菌以保证水质）冰冷的超纯水（过滤除菌以保证水质）重悬沉淀，然后加超纯水至50ml，轻轻混匀在整个过程中保持细胞冰冷分子生物学实验操作方法与技巧（5）电击-热激法制备超级感受态及转化的操作步骤（续）•5、 用用50ml50ml冰冷的超纯水洗两次（必要时可多洗一次），冰冷的超纯水洗两次（必要时可多洗一次），如上离心轻轻吸打重悬沉淀（注意：随着洗涤次数的增多，吸附在离心管上的细菌沉淀越来越松散，在倒上清液的时候很容易被倒掉或打散，因此要特别小心。

此外，为了解决这个问题，也可以每洗涤一次，适当增加5-10分钟的离心时间）•6、假如立即使用感受态细胞，洗完细胞两次后，用假如立即使用感受态细胞，洗完细胞两次后，用20ml20ml冰冷的超纯冰冷的超纯水重悬，然后离心（水重悬，然后离心（4 4˚C C，，5000g5000g，，2020分钟）用冰冷的超纯水重悬细分钟）用冰冷的超纯水重悬细胞（胞（50mL LB50mL LB菌液用菌液用1ml1ml重悬），最后分装成重悬），最后分装成50-100μL50-100μL小份，放在冰小份，放在冰上备用•7、假如储存感受态细胞，洗完细胞两次后，加入假如储存感受态细胞，洗完细胞两次后，加入20ml20ml冰冷的冰冷的10%10%甘油，甘油，然后离心（然后离心（4 4˚C C，，5000g5000g，，2020分钟）用冰冷的分钟）用冰冷的10%10%甘油重悬细胞，然甘油重悬细胞，然后将其稀释至浓度为后将其稀释至浓度为2-3X102-3X101010个细胞个细胞/mL/mL（（1.0 OD600≈2.5X101.0 OD600≈2.5X101010个细胞个细胞/mL/mL，可以简单认为，，可以简单认为，50ml50ml初始菌液，用初始菌液，用10%10%甘油重悬后最终产生甘油重悬后最终产生0.8mL0.8mL感受态）感受态）,分装成50-100μl的小份，用干冰或液氮速冻后储存在-80˚C(感受态制备好后，是否立即用液氮速冻有不同的观点。

分子分子克隆上认为该操作可提高转化效率克隆上认为该操作可提高转化效率5 5倍左右，但是我们和其他一些人倍左右，但是我们和其他一些人的实验结果发现感受态的转化效率在用液氮处理后反而下降了的实验结果发现感受态的转化效率在用液氮处理后反而下降了) )•8、保存在保存在-80°C-80°C冰箱中的电击感受态细胞一般最长可储存冰箱中的电击感受态细胞一般最长可储存6 6个月到个月到1 1年时间分子生物学实验操作方法与技巧（5）电击前的准备工作•1 1、提前、提前10-2010-20分钟开电击仪预热分钟开电击仪预热，以保证电击仪性能的稳定•2、将感受态细胞从-80˚C冰箱取出，在冰上自然解冻感受态细胞•3、解冻感受态细胞的同时，将电击杯放在冰上预冷解冻感受态细胞的同时，将电击杯放在冰上预冷必须保证电击杯有充分的预冷时间（新的电击杯可以直接使用旧的电击杯使用前从酒精中取出，待酒精完全挥发后，旧的电击杯使用前从酒精中取出，待酒精完全挥发后，在超净台中用超纯水洗涤两次，吹干水分后放在冰上备用在超净台中用超纯水洗涤两次，吹干水分后放在冰上备用使用过的电击杯应在水龙头上充分洗涤，然后用超纯水浸使用过的电击杯应在水龙头上充分洗涤，然后用超纯水浸泡数小时后浸泡在酒精中备用泡数小时后浸泡在酒精中备用）。

•4、分装分装1ml1ml的的SOCSOC培养基多管，以便在电击后立刻加入电培养基多管，以便在电击后立刻加入电击杯中SOCSOC不要放在冰上，而是放在放在3737˚C C水浴保温，以水浴保温，以便加入后产生一个热激效果便加入后产生一个热激效果分子生物学实验操作方法与技巧（5）电击转化步骤•1、将要电击的DNA准备好，放在冰上预冷•2、在电击前1分钟，取80μL解冻的感受态细胞，和1-2μL DNA在一个预冷的eppendorf管中混合（DNADNA和细胞混和细胞混合时一定不要产生气泡，以免对电击产生影响合时一定不要产生气泡，以免对电击产生影响），然后加入电击杯中，放在冰上准备立刻电击最好每次混合一个样最好每次混合一个样品，电击完后再混合另外一个样品品，电击完后再混合另外一个样品，免得免得DNADNA因放置时间因放置时间太长而降解太长而降解）•3、设置电击参数不同的电击仪对电击参数设置的要求不同，具体请参阅相应仪器的使用手册这里我们以本实验室使用的Eppendorf公司的Electroporator2510型电击仪为例，说明其电击参数的设置该电击仪仅有电压参数可以设置通常在细菌电击时，0.2cm0.2cm的电击杯设置的电击杯设置2500V2500V的电压，的电压，0.1cm0.1cm的电击杯设置的电击杯设置1600-1800V1600-1800V的电压。

成功的的电压成功的电击实验，其时间常数一般约为电击实验，其时间常数一般约为4-6ms4-6ms分子生物学实验操作方法与技巧（5）电击转化步骤•4、将电击杯从冰上取出，擦干水分擦干水分，放好后，连按两次Pulse键（2秒内）开始电击（注意，电击注意，电击时，电击杯中样品不能有任何气泡时，电击杯中样品不能有任何气泡•5、尽可能快地取出电击杯，立即加入预先准备好尽可能快地取出电击杯，立即加入预先准备好的、放在的、放在3737˚C C 保温的保温的1mL SOC1mL SOC培养基，轻轻混匀培养基，轻轻混匀后，吸出电击液放入一个无菌的后，吸出电击液放入一个无菌的1mL eppendorf1mL eppendorf管管中4646˚C C 热激热激6min6min记下本次电击的时间常数，然后37˚C、225rpm复苏培养1小时•6、涂布不同稀释度不同稀释度的转化菌液各100μl到一个含有抗生素的LB平板上，倒置培养12-16小时观察结果分子生物学实验操作方法与技巧（5）重组质粒的筛选•倒置培养12-16小时后,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板，观察转化子的颜色（此时可将平板放于4℃3-4小时,使显色完全）。

带有pUC19载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在含有X-galX-gal和ITPGITPG的LB培养基上为蓝色菌落而带有重组质粒（pUC19载体上插入了外源片段）的转化子由于外源片段的插入而丧失了β-半乳糖苷酶活性,在含有X-gal和ITPG的LB培养基上为白色菌落据此可将含有重组质粒的转化子筛选出来据此可将含有重组质粒的转化子筛选出来（这种筛选方法也称为（这种筛选方法也称为α-互补）） 分子生物学实验操作方法与技巧（5）酵母转化方法•酵母转化效率远低于大肠杆菌，化学转化法不仅效率低、步骤繁多而且需要制备原生质体，所以目前很少有人用化学转化法转化酵母，电击几乎成了实验室转化酵母电击几乎成了实验室转化酵母的最常用的、甚至是唯一的方法的最常用的、甚至是唯一的方法分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation protocol for Pichia pastoris•Eppendorf Electroporator 2510, cuvette: 2mm gap width.•Growth medium YPD(1% yeast extract,2% bactopeptone,2% dextrose)•Washing solution Ice-cold sterile bidistilled water; ice-cold sterile 1M sorbitol.•Electroporation solution Ice-cold sterile 1M sorbitol.•Outgrowth plates YPDS(1% yeast extract,2% bactopeptone, 2% dextrose,1M sorbitol,2% agar)•Cuvette 2mm gap width分子生物学实验操作方法与技巧（5）Making electrocompetent cells•1. Streak pichia cells from a glycerol stock (30% glycerol) onto YPD plates to grow single colonies.•2. Inoculate 10 ml YPD with one colony and grow 12-14 h with shaking at 30 C to an O.D. 600 of  3.0. It is important to have healthy log phase cells.•3. Inoculate 250 ml YPD with an aliquot of the overnight culture to reach an O.D. 600 of 0.005 and grow  12 h to an O.D.600 of 1.0-1.3.•4. Harvest by centrifugation at 1500g for 5 min at 4 C.•5. Gently resuspend in 250 ml ice-cold ddH2O using a glass pipette, centrifuge as above.•6. Repeat washing step with 125 ml ice-cold ddH2O.•7. Resuspend in 20 ml ice-cold sorbitol and centrifuge as above. Resuspend in 0.5 ml of 1 M sorbitol and keep on ice. Use the cells that day.分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation of cells•1. Add 10  l DNA (5-10  g,通常需要通过酶切使质粒线性化通常需要通过酶切使质粒线性化) to 80  l of electrocompetent cells. Gently mix with a blue-tip pipette several times. Transfer mixture into a prechilled cuvette and incubate on ice for 5 min.•2. Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.•3. Electroporation:•Voltage (V)                1,500 V•Time constant ()        5ms•4. Immediately add 1ml of ice-cold sorbitol to the cuvette. Transfer sample to sterile 15ml tube and incubate for 2 h without shaking at 30  C.•5. Spread 200  l aliquots on YPDS plates and incubate for 3 days at 30  C until colonies appear. Number of colonies is increased about tenfold by adding 1 ml YPD and shaking for 3 h before spreading thus incubating for a total of 5 h.•Expected results:•Transformation efficiency up to 2   102 transformants/  g of DNA.• 分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation protocol for Saccharomyces cerevisiae  •Growth medium YPD(1% yeast extract,2% bactopeptone,2% dextrose)•Washing solution Ice-cold sterile bidistilled water; ice-cold sterile 1M sorbitol.•Electroporation solution Ice-cold sterile 1M sorbitol.•Cuvette 2mm gap width 分子生物学实验操作方法与技巧（5）Making electrocompetent cells•1. Inoculate 500 ml YEPD with an aliquot of an oernight culture or a colony from a plate and grow to an O.D.600 of 1.3-1.5 (about 1 108 cells/ml).•2.Harvest by centrifugation at 4000g for 5 min at 4 C. •3. Wash in 500 ml ice-cold sterile water, centrifuge (4000g,5 min, at 4C ), repeat washing step with 250 ml water.•4. Resuspend in 20 ml ice-cold sorbitol and centrifuge as above. Resuspend in 0.5ml of 1 M sorbitol to a final volume of 1.0 to 1.5ml, keep on ice.• 分子生物学实验操作方法与技巧（5）Electroporation of cells•1. Add < 5 l (0.1  g )DNA to 65  l of electrocompetent cells. Homogenize by gently mixing with pipette several times.•Incubate 5 min on ice. Transfer mixture into a prechilled cuvette.•2. Wipe moisture from the cuvette and insert the cuvette into the device.•3. Electroporation:•Voltage (V)           1500 V•Time constant ()   5 ms•4. Immediately add 1 ml of cold sorbitol. Plate various aliquots onto selective plates containning 1 M sorbitol.•Expected results:•Transformation effciency up to 104 to 105 transformants/ of DNA.•Note:•It is possible to scale this protocol down by starting with a culture volume of 50ml.分子生物学实验操作方法与技巧（5）毕赤酵母的电击转化方法2（for Biorad Electroporator）•仪器：Bio－Rad Gene PulserII型，0.2cm电激杯。

菌株：毕赤酵母GS115•1.1.准备线性化准备线性化DNADNA：：•（1）用Sac I、BstXI或PmeI 酶切1010 g g左右左右的重组表达载体DNA,2h或过夜酶切；•（2）取酶切线性化D NA补水至300 l,加300 l酚／氯仿／异戊醇（25：24：1）混合液，颠倒混匀；•（3）12000rpm，5min；•（4）取上清，加750 l乙醇，30 l 3M NaAC,放在-20C 30min;•(5) 12000rpm, 10min;•(6)80%乙醇清洗,吹干;•(7)加入 10 l 水重溶DNA，放于－20 C 保存备用•注意：•酶切后的质粒酶切后的质粒DNADNA推荐通过纯化试剂盒来回收！推荐通过纯化试剂盒来回收！分子生物学实验操作方法与技巧（5）毕赤酵母的电击转化方法2（for Biorad Electroporator）•2.准备对数生长期酵母菌：•（1）挑单菌落接种于5ml YPD 液体培养基30 C ,250 rpm培养过夜；•（2）取过夜培养的菌液0.1-0.5ml接种于50 ml新鲜YPD液体培养基中，在30 C 培养至 OD600＝1.3-1.5；•（3）4 C ，1500g离心5min,用50ml 0 C 无菌水重悬菌体；•（4）离心同上，再重悬于25ml 0 C 无菌水中；•（5）离心同上，重悬于20ml 0 C 1M山梨醇溶液；•（6）离心同上，再重悬于1ml 0 C 1M山梨醇溶液，置于冰上（当天使（当天使用）用）。

分子生物学实验操作方法与技巧（5）毕赤酵母的电击转化方法2（for Biorad Electroporator）•3. 电击：•(1)将制备的细胞80 l 和5 5－－10 10  g g线性化线性化DNADNA注入0 C 电激杯，混匀，置冰上5min;•(2)设置电击参数（电压：（电压：1500v,1500v,电容：电容：25 25   F F；电阻：；电阻：400400 （也有用（也有用200 200   的），时间常数为的），时间常数为4 4－－5ms5ms））电击细胞，电击后立刻在电激杯内加1ml 0 C 1M 山梨醇溶液，混匀;•（3）将杯子里的液体转至1.5ml微量离心管，30 C培养1－2h; •(4) 取100 l 菌液涂布在含100 g/ml ZeocinZeocin的YPDS平板，剩余菌液保存或全涂布在另外的含100 g/ml Zeocin的YPDS平板平板上，30 C 培养3－4天分子生物学实验操作方法与技巧（5）转化中的对照•在每一个实验中，应设有阳性对照，以估计转化效率；设立阴性对照，以消除可在每一个实验中，应设有阳性对照，以估计转化效率；设立阴性对照，以消除可能的污染及查明可能的失败原因。

能的污染及查明可能的失败原因•阴性对照：•在转化实验中，必须设立一份不加必须设立一份不加DNADNA只有感受态细胞的对照管，而且独立铺于一只有感受态细胞的对照管，而且独立铺于一个含有适量抗生素的平板，正常情况下不应该有克隆长出，如果有下列情况，必个含有适量抗生素的平板，正常情况下不应该有克隆长出，如果有下列情况，必须引起重视须引起重视•在实验中，感受态细胞被有抗生素抗性的菌株所污染可能是某种试剂或溶液在在实验中，感受态细胞被有抗生素抗性的菌株所污染可能是某种试剂或溶液在转化过程中被污染转化过程中被污染•选择性平板失效可能是平板中忘记加抗生素或加抗生素时琼脂太热了•选择性平板被某种具有抗生素抗性的菌株污染这种情况，克隆常长在平板的边缘或培养基的中间•阳性对照：•转化实验中应设立一个标准转化管，里面加已知量超螺旋质粒DNA和感受态细胞，以计算本次实验的转化效率我们建议先制备一大批稀释的质粒我们建议先制备一大批稀释的质粒DNADNA，，1ng/ml 1ng/ml 用用于电转化实验正对照，于电转化实验正对照，500ng/ml用于转化CaCl2处理的感受态细胞,两种浓度的质粒需用TE(pH8.0)溶解并贮存于-70C,每个转化实验都必须用2-5l 的质粒转化新鲜制备的感受态细胞并计算转化率.如果没有克隆长出,说明感受菌或转化缓冲液或操作有问题.•当用连接产物做转化时当用连接产物做转化时, ,它比超螺旋质粒它比超螺旋质粒DNADNA的转化效率至少低的转化效率至少低2 2个数量级个数量级,每微克连接DNA所能获得的真正转化子取决于连接反应所产生的重组质粒的量,以及转化反应中的抑制物如琼脂或酶。

•连接反应连接反应DNADNA的纯度对于转化效率至关重要，尤其是在电击转化中！的纯度对于转化效率至关重要，尤其是在电击转化中！分子生物学实验操作方法与技巧（5）产品推荐•由于感受态细胞是一种对温度非常敏感的产品，因此运输过程中（即使是干冰运输）会导致转化效率大幅度下降因此尽管有很多感受态细胞出售，但没有一种敢担保使用时能达到标称的效率•由于上述原因，不推荐大家购买商品化的不推荐大家购买商品化的感受态细胞应该自己制备感受态细胞应该自己制备分子生物学实验操作方法与技巧（5）分子生物学实验操作方法与技巧（5）。