ELISA检测方法的不同操作规程对猪瘟抗体的影响.docx

    ELISA检测方法的不同操作规程对猪瘟抗体的影响    刘小兰，姜树林,李雯（江西省畜牧技术推广站，江西 南昌 330046）2011年3~6月，对720头育肥猪进行了猪瘟抗体水平检测并分组进行试验通过查阅文献和根据其他规模猪场的操作规程，将不同形式接种猪瘟疫苗试验组分为：不同猪瘟疫苗组分为细胞苗组（Ⅰ组）和组织苗组（Ⅱ组）、不同猪瘟免疫程序试验组分为Ⅲ组和Ⅳ组、不同猪瘟免疫剂量分为Ⅴ组和Ⅵ组，Ⅲ组免疫程序是猪瘟首次免疫在21日龄免疫2头份、二次免疫在55日龄免疫4头份，Ⅳ组免疫程序是猪瘟首次免疫在28日龄免疫2头份、二次免疫在55日龄免疫4头份；Ⅴ组的免疫剂量是首次免疫2头份、二次免疫4头份，Ⅵ组的免疫剂量是首次免疫4头份，二次免疫8头份二次免疫30天后检测抗体水平通过本试验，可以初步判断原来的猪瘟疫苗接种操作规程的合理性1 试验材料1.1 被检血清猪只在接种猪瘟疫苗后30 d随机采血，血样经处理后获取血清（血液冷凝，3 000 r/min离心5 min，取上清液），各试验组采取血清均为120份1.2 主要试剂猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品公司，在有效期内使用。

包括已包被好抗原的微孔板，标准阴、阳性对照血清，抗猪Ig-HRP结合物，10倍浓缩洗涤液，TMP底物四甲基联苯胺（TMP）液、双氧水（H2O2）液，终止液，样品稀释液等1.3 主要仪器设备（见表1）2 试验方法2.1在血清稀释板中按1∶40的体积稀释待检血清（195 μL样品稀释液中加5 μL待检血清）此外，阳性对照和阴性对照也按1∶40稀释，即234 μL样品稀释液中加6 μL对照血清2.2 取预包被的检测板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100 μL加入到检测板孔中阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100 μL轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30 min2.3 甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200 μL/孔，每次静置3 min后倒掉，再在干净吸水纸上拍干2.4 每孔加羊抗猪酶标二抗100 μL，置37℃温育30 min2.5 洗涤5次, 方法同上每次均在干净吸水纸上拍干2.6 每孔先加底物液A一滴（50 μL）、再加底物液B一滴（50 μL），混匀，室温(18℃~25℃)避光显色10 min2.7 每孔加终止液1滴(50 μL)，10 min内测定结果（测定前在震荡器上轻轻震动一下）。

2.8 测定OD值以空白孔调零，在酶标仪上测定各孔的光密度（OD630）值，所用波长为630 nm2.9 判断标准用猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测的阴性对照平均OD630值必须小于0.3，阳性对照平均OD630值必须大于或等于1.0试验才成立当样品检测的OD630值大于0.35时判为阳性，小于0.35时判为阴性3 试验结果3.1 标准对照血清的检测此次试验共做标准阳性和阴性血清各16份，反应后测定OD630值，阳性血清平均值为0.12，阴性血清平均值为1.08对照系统正常，试验成立3.2 血清猪瘟抗体检测共检测血清720份，具体情况见表2和下图4 分析与讨论4.1 表2和上图表示，Ⅰ组和Ⅱ组的猪瘟抗体检测阳性率分别为：33.33%与34.17%，没有明显的差异，说明现在市场上的猪瘟组织苗和猪瘟细胞苗的免疫效果基本相似据王在时等[1]的试验研究发现，我国疫苗株对我国目前流行的不同毒力、不同地域、不同分离时间以及不同基因亚群的多个野毒进行单独、混合、交叉、一次及多次攻毒，均能获得完全保护，说明我国现用的猪瘟弱毒疫苗对目前流行的猪瘟野毒仍然有效，初步证明现用疫苗的免疫原性没有发生改变，说明我国的疫苗有较高的保护力。

但是本省大部分猪场猪瘟疫苗都是从本地经销商处购买，而本地经销商一般都要经过几个环节才能得到，很大一部分经销商，尤其是偏远地区，在高温季节，停电情况时有发生，很难保证其销售出去的疫苗质量4.2 Ⅲ组和Ⅳ组的猪瘟抗体检测阳性率分别为：38.33%与34.17%，Ⅲ组略高于Ⅳ组，没有大的差异，说明猪场的猪瘟免疫程序基本是合理的据赵再会等人研究报道，免疫次数过于频繁，会扰乱免疫应答，也就是说上次注射的疫苗产生的抗体还没有降到一定的水平时，再次注射与上次接种相同的疫苗，疫苗会被机体内残留的那部分抗体中和，导致机体不能产生足够的抗体[2]，本试验的数据说明Ⅲ组试验的免疫程序相对来说更为合理，但两试验组之间没有大的区别这也就说明猪场的猪瘟免疫程序没有存在根本问题，也不是导致猪瘟抗体水平剧烈下降的重要因素4.3 Ⅴ组和Ⅵ组的猪瘟抗体检测阳性率分别为：35.83%与36.67%，没有明显差异，说明猪场猪瘟疫苗接种剂量基本合理李芳萍等人的研究证明，猪瘟抗体水平高于1:80时注苗,则免疫效果差[3]这说明该猪场的猪瘟疫苗接种剂量对猪瘟抗体水平没有很大4.4 根据2006年3~6月期间的三个试验的数据可以初步判断，引起猪场猪瘟抗体水平出现大波动的主要原因是由于猪蓝耳病病毒和猪圆环病毒的感染所引起，由于这两个病毒的免疫抑制作用，使得机体对猪瘟疫苗的免疫应答反应迟钝或不应答，导致猪瘟免疫失败，甚至疫苗毒力出现返强而引发猪瘟，同时还会引起其它病原微生物的继发感染，使猪的健康进一步下降，免疫功能也随之下降，多重的作用使得猪瘟抗体水平越来越低，也使猪场的疾病复杂化。

4.5 猪瘟仍然是威胁我国养猪业的重大传染病之一许多猪场猪群的猪瘟抗体水平依然低下，大家都在不断寻求解决办法根据试验结果可知，正常的猪瘟疫苗、正常免疫程序及正常免疫剂量等都不会引起猪瘟抗体水平的巨大波动，但是当猪群感染猪蓝耳病和猪圆环病毒等时，猪的免疫系统就会受到抑制，使免疫应答反应反应迟钝，影响猪瘟抗体的产生此外，霉菌毒素会影响机体的免疫应答，如几乎所有的霉菌毒素都对免疫系统有破坏作用[5]，烟曲霉感染可引起嗜中性粒细胞表达L-选择素水平下降，导致嗜中性粒细胞向病原移动的能力和吞噬消灭病原的功能受损，黄曲霉素B1和新月霉菌产生的T-2毒素会抑制蛋白质合成和细胞增殖，从而使机体免疫机能受到抑制；药物及营养等因素也都会影响机体的免疫机能，如土霉素、卡那霉素、磺胺类药对机体B淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用，缺乏维生素A、维生素E、铁、锌等营养物质也会导致机体的免疫力下降，导致机体不能产生足够的抗体[6]4.6 影响猪瘟抗体水平的因素很多，在养猪生产实践中运用ELISA方法检测猪瘟抗体具有非常重要的意义，建议大型规模猪场用ELISA试剂盒定期检测猪瘟抗体，以期制定合理的免疫程序，控制猪瘟的发生。

Reference：[1]王在时.我国猪瘟长期持续存在的根源与综合防治技术对策.第八届全国规模化猪场主要疫病控制与净化专题研讨会论文集，9~14[来自Www.lw5u.Com].[2]赵再会,韩天昌,张帅.猪瘟免疫失败的原因[J].江西畜牧兽医杂志,1998,(2): 34~35.[3]李芳萍,刘忠诚,孙丽蓉等.根据抗体监测实施猪瘟免疫效果好[J].养猪,2001,(2):44.[4]William L. Casale, James J. Pestka, and L. Patrick Hart. Enzyme-linked Immunosorbent Assay Employing Monoclonal Antibody Specific for Deoxynivalenol (Vomitoxin) and Several Analogues[J]. J. Agric. Food Chem., 1988, 36：663~668.[5]Ramesh C. Sinha, Marc E. Savard, Rhoda Lau. Production of monoclonal antibodies for the specific detection of deoxynivalenol and 15-acetyldeoxynivalenol by ELISA[J]. J. Agric. Food Chem. 1995, 43: 1 740~1 744.[来自WWW][6]邓何生，李玉萍，张业洪.Dot-ELISA检测规模化猪场猪瘟抗体水平[J].广西畜牧兽医，2004，20（6）：246~247.（收稿日期：2012-08-17）  -全文完-。