酶类药物的分析06-12-04(生科院).pptx

氨基酸定量n（一）茚三酮法n（二）三硝基苯磺酸法n（三）铜复合物紫外吸收法n（四）甲醛滴定法n（五）非水溶液滴定法n（六）双波长分光光度法n（七）导数分光光度法n（八）HPLC法1蛋白质分子量测定n超离心沉降速度n离心沉降平衡n凝胶过滤柱层析nSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳n梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳2蛋白质定量法n凯氏定氮法n双缩脲法n福林酚法n紫外光吸收法n考马斯亮蓝G-250法nBCA3蛋白质组成氨基酸分析n氨基酸自动分析仪测定原理n蛋白水解法：n1、盐酸水解法n 2、磺酸水解法n 3、碱水解法n 4、酶水解法4酶类药物的分析第一节概述第二节酶类药物的鉴别与检查第三节酶活力测定方法第四节酶活力测定方法设计第五节典型酶类药物的检测5第一节概述n在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡n一、酶的特性n二、酶的分类n三、酶的化学组成n四、酶的催化反应机制n五、酶催化反应动力学6一、酶的特性1酶是高效催化剂n2酶对底物的结构具有严格的选择性n（1）相对专一性：n（2）绝对专一性:n（3）立体异构专一性:n3酶催化反应的反应条件温和n4酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。

7二、酶的分类n氧化还原酶n转移酶n水解酶n裂合酶n异构酶n合成酶（或称连接酶）8三、酶的化学组成n分为简单酶和结合酶两大类n结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称为“全酶”，才呈现生物催化活性n结合酶=酶蛋白+辅助因子9四、酶的催化反应机制n1酶-底物复合物的形成在酶促反应中，反应底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶-底物复合物，降低反应的活性能，使酶促反应顺利进行n2酶-底物复合物加速反应速率的原因n（1）定向作用与底物浓缩n（2）酶使底物分子变形n（3）酸碱催化n（4）共价催化10五、酶催化反应动力学n酶的活力单位 酶活性单位（U）是酶活性高低的一种量度，用U/g或U/ml表示n酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化1mol底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位n酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg11Michaelis-Menten快速平衡学说n底物浓度的增加，反应速度上升呈双曲线n在低底物浓度时，反应速度呈直线上升，表现为一级反应n在高浓度时，反应速度达到一个极限值，呈现零级反应12米氏方程n酶反应动力学方程式：nV反应初速度nVm最大反应速度nKs 米氏常数，Ks=K1/K1，Ks为ES的解离常数，表示酶与底物的亲和力。

nKs为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓度，即V=1/2Vm时，Ks=S13Briggs-Haldane稳态学说nES的形成速度与ES的解离速度相等，达到动态平衡，即“稳态”，反应方程式：nKm取代了Ks，当V=1/2Vm时，Km=SnKm也可表示为底物与酶的亲和力14第二节 酶类药物的鉴别与检查n鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件下的双缩脲反应n专用于酶的鉴别方法：n 酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）n 沉淀试验：胃蛋白酶n 动物试验：透明质酸酶水解粘多糖15酶类药物的检查n酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有含量限度16酶类药物的检查n（一）脂肪含量限度检查n检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪不得过规定的含量n（二）其他酶类含量限度检查n胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提取的蛋白分解酶提取胰蛋白酶时又易带入微量的糜蛋白酶n（三）大分子活性物质含量限度检查17胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量n每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶n糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。

n用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-TyrosineEthylester，ATEE）作底物，通过分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查该酶的含量限度18第三节酶活力测定方法n固定时间法n连续监测法n固定浓度法19一、固定时间法n在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的量从而间接推算出酶的含量（或活力）nnE表示酶浓度，P为反应产物浓度，t表示酶作用时间，K为常数20注意事项n缺点：无法了解整个反应过程是否都是零级反应n注意事项：n1、底物饱和n2、时间21二、连续监测法n在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量n（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法n（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法22（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：n还原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有紫外吸收，氧化型辅酶（NAD+和NADP+）在340nm处无紫外吸收.n利用340nm处每分钟吸收度升高或降低的速率与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位n包括：n直接测定法n偶联法n三联酶活测定23直接测定法n大多数需NADH（NADPH）参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在340nm处吸收度的变化，计算酶活力单位。

n丙酮酸NADHH+乳酸NAD+n340nm处吸收度降低的速率与NADH的氧化速率成正比，与LDH的活力成正比24偶联法n此类酶催化反应不需NAD+或NADP+，但当与需NAD+或NADP+的脱氢酶反应偶联以后，能用紫外分光光度法测定.n由脱氢酶引起的反应为指示反应，脱氢酶是指示酶，指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍n例如：谷草转氨酶的测定：25三联酶活测定n引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来，组成一个“三合一”酶反应系统，使底物转化率、辅助酶反应和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系，辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力n例如：磷酸肌酸+ADP肌酸ATP(1)n葡萄糖ATPG-6-PADP(2)nG-6-P+NADP+葡萄糖酸-6-磷酸NADPHH+(3)n(1)被测反应，(2)辅助反应，HK（己糖激酶）辅助酶，(3)指示反应，G-6-PDH（6磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶26（二）不需NAD+或NADP+指示的连续监测法：n酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身无色，经酶作用后释放出有色的反应产物根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。

n例如：n磷酸对硝基苯酚酯 对硝基苯酚27三、固定浓度法n根据酶催化反应，使反应产物达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的nP=KEtn测定时间.n以所需时间的倒数（1/t）对酶浓度作图即可制备标准曲线n优点：1、记录时间2、准确28第四节 酶活性测定方法的设计n一、影响因素n二、底物与产物的测定方法n三、测定条件的选择29一、影响因素n1、底物n2、pHn3、温度n4、酶浓度n5、空白和对照30底物n酶可以同时作用多个底物n以Km最小者作为此酶的生理底物n从底物性质看，选用的底物最好在物理化学性质上与产物不同，利于测定n从底物浓度看，为不使酶反应受到它的控制，反应系统应使用足够高的底物浓度31胰凝乳蛋白酶几种底物的Km底物Km（mmol/L）N苯甲酰酪氨酰胺2.5N甲酰酪氨酰胺12.0N乙酰酪氨酰胺32.0甘氨酰酪氨酰胺122.032底物浓度对酶反应速度的影响S/KmV/Vmax0.010.990.11.015010911009933pHn酶活力测定选用缓冲体系n不同缓冲液所受影响不同磷酸盐所受影响较小，而Tris则受影响较大n酶溶液用量与底物溶液比例不超过10为宜。

34温度n温度变化1，反应速度可能相差10以上，控制在0.1n反应温度一般为25，此时酶不易灭活，Km较小，可以使用较低的底物浓度n有些酶在37不稳定35酶浓度n酶样要充分稀释n取3个不同酶量测得的产物量和酶浓度之间为正比关系，这样的酶浓度范围就是适当的36空白和对照n空白：指杂质反应或自发反应引起的变化量，代表未知因素的影响n分为完全空白（如测定时要终止反应，则空白可先加终止反应试剂再加酶）n酶空白n底物空白37二、底物与产物的测定方法（酶反应的检测方法）1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值n2、分光光度法：常用的有比色法和紫外分光光度法n3、荧光测定法：简单、灵敏、快速n4、电化学分析法n（1）离子选择性电极分析法n（2）微电流法n5、其他方法n如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法38三、测定条件的选择n1、单因素选择n2、正交设计多因素选择391、单因素选择比色法测溶菌酶活性n以染料艳红K-2BP标记的MLysodeikticus为底物，分解后产生游离染色碎片（产物）n离心除去未分解底物，上清液比色n吸收度为溶菌酶活力的函数40测定条件选择SpHn（1）酶反应底物浓度曲线n以染料标记的MLysodeikticus为底物，酶含量为20g时，1%底物浓度已接近使酶饱和。

n（2）酶反应PH曲线n磷酸缓冲液和柠檬酸磷酸缓冲液n不同组分的缓冲液，其最适PH稍有不同，选用pH6.5磷酸缓冲液41测定条件选择离子强度、反应时间及En（3）离子强度对酶反应的影响n离子强度在0.3mol/L以上为宜，选用0.5mol/Ln（4）酶反应过程曲线(反应时间)和酶浓度曲线n酶量为20g时，反应在30分钟以内，吸收度与反应时间有良好的线性关系，测定系统选用15分钟n酶量在50g之内，吸收度与酶浓度具有线性关系42测定条件n1%染色菌体缓冲液1mln37水浴保温约5分钟n加酶试样0.5ml准确反应15分钟n加入酸/乳化剂混合液2ml，终止反应，反应液经离心，上清液于540nm比色，所得吸收度从酶浓度标准曲线即可查出试样中溶菌酶含量43二、正交设计多因素选择n正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是一种高效的利用正交表来安排多因素多水平设计试验的方法n通过巧妙的安排和分组，用较少的试验次数，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的试验条件n利用各因素所对应指标的极差R及平均极差D作出判断44正交试验优选中性蛋白酶活力测定条件n中性蛋白酶是一种蛋白水解酶，它的活力测定主要是以酪蛋白为底物，在适宜的条件下，中性蛋白酶催化底物水解，水解产物与福林试剂在碱性情况下反应生成有色物质，于680nm处测定吸收值，以酪氨酸为标准对照品计算其活力。

n中性蛋白酶的催化作用受缓冲液的pH值、底物浓度、反应时间及酶浓度等因素的影响n供试品：0.01%的中性蛋白酶溶液n底物：酪蛋白45实验方案n实验取四个因素： PH值、底物浓度、反应时间、酶浓度n每个因素选三水平、属于多因素多水平，为此选用L9（43）正交表进行实验46正交试验表n实验号 A缓冲液pH 值B底物浓度(%)C反应时间(min)D酶浓度（U/ml）11111212223133342123522316231273132832139332147正交实验安排表nn48正交实验安排表49各因素试验值计算结果n平均极差越大，对应的因素影响越大n缓冲液PH值7.2，底物浓度0.5%，酶浓度用100U/ml为最佳反应条件n反应时间为10，20，30min，对OD值无显著影响50各因素试验值的方差分析结论：PH值（A）、底物浓度（B）、酶浓度（D）为非常显著因子；反应时间（C）为非显著因子51第五节酶类药物的检测n肽键水解酶n脂键水解酶n糖苷键水解酶n其它（超氧化物歧化酶）52一、肽键水解酶n1、胰蛋白酶n2、弹性蛋白酶n3、尿激酶531、胰蛋白酶比色法n胰蛋白酶：由牛、羊、猪等动物的胰脏中提取的一种蛋白水解酶。

n牛胰蛋白酶：233个氨基酸，分子量24000，等电点10.1n猪胰蛋白酶：214个氨基酸，分子量23400，等电点10.8n胰蛋白酶最适pH为7.68.0，电泳纯的胰蛋白酶的比活为8000单位/mg。