Clec2在MDS患者中的表达及其与TPO的相关性.docx

Clec2在MDS患者中的表达及其与TPO的相关性骨髓增生异常综合征是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，向急性髓系白血病（AML）转化的高风险[1,2]原发性MDS的发病机制尚不明确近年来有研究结果表明，造血干细胞和造血微环境的改变在MDS的发病过程中起着重要的作用钙离子依赖型凝集素样受体2是血小板和巨核细胞内特异性表达的蛋白，而巨核细胞是调节骨髓微环境的重要成分本研究通过检测MDS患者的血浆游离clec2的水平，分析其与TPO及MDS患者临床特征的关系，并且通过对MDS的骨髓微环境的深入研究，进一步了解疾病的发生及进展机制，这有助于未来对分子靶向治疗药物的开发1、材料和方法1.病例资料2016年1月至2017年10月于中国医科大学附属第一医院门诊及病房通过骨髓细胞学确诊的骨髓增生异常综合征患者共47例，其中男26例，女21例，中位年龄57(23-84）岁；初治31例，复治16例47例MDS患者根据2016年WHO分型标准，MDS-SLD10例（21.3%),MDS-MLD5例（10.6%),MDS-RAS6例（12.8%),MDS-EB21例（44.7%),MDS-U5例（10.6%）。

同时随机选取体检中心年龄、性别与实验组相匹配的体检健康者20例作为对照组血标本皆为送检的空腹采集的外周抗凝血，血样经离心后留取血浆备用2.试剂与仪器人clec2ELISA试剂盒购自美国RayBiotech公司，人TPOELISA试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司（中国）全自动酶标仪为美国BioTek公司产品常温离心机为长沙湘仪（中国）出厂患者外周血clec2和TPO表达的ELISA方法检测采取患者空腹外周抗凝血3ml,1200×g离心10min，之后留取上层血浆进行试验首先制作标准品，然后加空白孔及待测样本各50μl，于37℃孵育30min，洗涤5次后拍干，加入酶标试剂50μl，再次孵育及洗涤，最后加入显色试剂50μl,37℃下避光显色15min，加入终止液50μl，以空白孔调零，全自动酶标仪450nm波长测定各孔的吸光度（OD值）根据标准品OD值绘制标准曲线，然后计算各样本的clec2和TPO浓度3.统计学分析应用SPSS18.0统计学软件进行数据处理，clec2及TPO检测值用均数±标准差表示，2组数据之间均数比较采用t检验，多组数据间均数比较采用方差分析，clec2与TPO之间关系采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果MDS组与对照组血浆clec2水平的比较MDS患者血浆clec2水平为347.9±121.5ng/ml，明显高于正常对照组（171.5±57.6ng/ml)(P<0.01）（图1）；且化疗后复治患者clec2水平为288.6±98.7ng/ml，较初治患者（375.4±124.3ng/ml）有所下降（P<0.05）（图2）MDS各亚型之间clec2水平比较MDS患者WHO分型各亚型之间clec2水平无明显统计学差异，而各亚型clec2水平均高于正常对照组,差异有明显统计学意义（P<0.01）（图3，附表）MDS患者临床特征与clec2表达水平的关系分析患者临床资料，流式细胞术检测结果显示，P3细胞（恶性细胞）增高组的clec2水平高于P3细胞正常组，但骨髓细胞学检测中原始细胞数不同组间的clec2水平无差异另外，clec2水平在不同性别、年龄、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数之间无明显差异（附表）MDS患者clec2与TPO水平的关系在47例MDS患者中，42例同时检测了血浆clec2和TPO水平，并将这2个指标进行了相关性分析结果显示，2者呈正相关（r=0.419）（图4）。

3、讨论MDS发病机制复杂，MDS细胞的异常增殖与细胞分化异常、遗传学异常、酪氨酸活化及骨髓微环境改变密切相关近年来，越来越多的研究表明，骨髓微环境异常在MDS发病机制及患者预后方面发挥着重要的作用[3,4]正常骨髓微环境由骨髓基质细胞、生长因子和细胞因子组成其中骨髓基质细胞包括骨祖细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、单核细胞和巨噬细胞等异常的骨髓微环境，如与血细胞恶性克隆的相互作用、造血生长因子产生不足和细胞因子的异常分泌等，均参与和维持MDS克隆的发生和进展骨髓单核-巨噬细胞作为骨髓微环境的重要组成部分，在MDS的发生、发展及预后中发挥着重要作用有研究表明，MDS患者骨髓中巨噬细胞数量明显增多，同时异常分泌某些细胞因子，如白细胞介素6和肿瘤坏死因子α，可促进骨髓细胞的凋亡[5]进一步研究发现，MDS患者的巨噬细胞内存在铁增加现象，由此引起巨噬细胞表达的血红素氧合酶-1增加，导致MDS患者预后不良[6]Clec2最早从人骨髓细胞内被克隆出来的，表达在骨髓来源的多种血细胞上，如单核细胞、粒细胞和树突状细胞上[7]后来发现，clec2蛋白在人类血小板、巨核细胞系、肝窦内皮细胞、肝脏枯否细胞均有表达[8,9]。

Clec2在不同细胞中表达存在差异性，表达量相对较多且相对特异性的是血小板和巨核细胞，而其他细胞表达量较低[10]同时，clec2是巨核细胞特异表达的前25个基因之一有研究表明，TPO在MDS中表达增加，是调控骨髓造血的因子，但是骨髓中TPO的调控机制尚不明确[11]近年来，有学者研究发现小鼠骨髓的巨核细胞可高表达clec2，缺失clec2的巨核细胞表现为TPO合成和造血龛功能受损，并影响造血干细胞细胞周期平衡及分化潜能实验表明骨髓巨核细胞表达的clec2通过调节TPO的表达参与骨髓微环境中造血干细胞的存活、增殖和分化[12]本研究选择了骨髓造血功能异常的MDS病例，结果显示MDS患者的clec2水平明显升高，尤其是初治MDS患者进一步研究发现，其与TPO水平存在正相关这表明，在MDS患者中clec2/TPO可能存在相互作用，影响着MDS患者骨髓微环境的变化，具体的分子机制还有待于进一步研究在本研究的骨髓原始细胞分组比较中发现，骨髓细胞学原始细胞数不同组间clec2表达水平无明显差异；通过流式细胞术对骨髓恶性细胞分类的clec2水平进行检测，P3细胞（恶性细胞）增高组患者clec2水平与P3细胞正常组相比，2组存在统计学差异，推测clec2在髓系细胞的进一步分化中可能发挥调控作用。

本研究未能获取全部病例的遗传学资料，尚存在局限之处，因此未能对IPSS预后分层进行血浆clec2水平比较，后续研究可扩大样本量，同时进一步对骨髓上清及骨髓单个核细胞进行深入的基因及蛋白水平检测综上所述，微环境异常是多种细胞因子、造血因子、信号通路及免疫机制综合作用的结果因此，近年来骨髓微环境调控MDS引起了许多学者的关注对MDS骨髓微环境的深入研究可进一步明确骨髓微环境调控MDS的细胞学及分子生物学方面相关机制，不仅有助于阐明MDS发生及发展过程中复杂的分子机制及信号途径，亦有利于进一步认识该病的发病、进展及预后相关因素，从而有助于明确分子靶向治疗的发展方向金晶纯,郝一文.Clec2在骨髓增生异常综合征患者中的表达及其与TPO的相关性[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1643-1647.。