Ni树脂再生之详细步骤(共2页).doc

精选优质文档-----倾情为你奉上镍柱琼脂糖树脂（Ni-NTA resin）再生方法摘 要： 镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸（碱性氨基酸）标签的重组蛋白而设计，具有高度的亲和力和选择性当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时，需彻底再生后才能使用再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等三个步骤先用变性剂和乙醇除去残余蛋白和脂类，再用EDTA与金属镍离子螯合去除镍，然后用NiSO4进行挂镍 蛋白中的组氨酸残基可以和许多金属离子，例如锌、铜、镍、铁等形成复合物因此，带有金属离子的柱料能选择性螯合具有组氨酸残基的蛋白质半胱氨酸和络氨酸残基也能和固定化金属螯和，但是亲和力比组氨酸要弱金属螯和柱料主要是由亚氨基的乙酰乙酸成分耦联琼脂糖柱料镍柱纯化是为了纯化带有6个组氨酸标签的重组蛋白而设计的，Ni柱中的硫酸镍(NiSO4)可以与碱性蛋白结合镍柱纯化系统设计了镍柱琼脂糖对串联排列的6-His（碱性氨基酸）残基有高度的亲和力和选择性用咪唑洗脱目的蛋白时，咪唑会竞争性结合Ni，目的蛋白被洗脱下来 如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用3-5次。

通常在使用3-5次后，结合效率有所下降，需用0.5M NaOH洗涤，也可用6M盐酸胍加500mM咪唑洗5-6个柱体积，然后用结合缓冲液平衡后即可再使用但是，当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色或白色时，则镍离子已经从柱子中丢失，Ni-NTA树脂需彻底再生后才能使用再生方法总体可分为除去柱上残余蛋白、除镍、挂镍等几个步骤，具体方法如下：一、所需试剂：再生缓冲液：6M盐酸胍+ 0.2M乙酸2% SDS（m/V）25%、30%、50%、75%、100%的乙醇（V/V）100mM EDTA（pH8.0）溶液100mM NiSO4溶液二、镍柱（Ni-NTA）树脂再生步骤：（1）从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的再生缓冲液洗2）用2倍体积的去离子水洗3）用3倍体积的2% SDS洗4）用1倍体积的25%乙醇洗5）用1倍体积的50%乙醇洗6）用1倍体积的75%乙醇洗7）用5倍体积的100%乙醇洗8）用1倍体积的75%乙醇洗9）用1倍体积的50%乙醇洗10）用1倍体积的25%乙醇洗11）用1倍体积的去离子水洗12）用5倍体积的100mM EDTA pH8.0 洗13）用3倍体积的去离子水洗。

14）用2倍柱体积的100mM NiSO4洗15）用2倍柱体积的双蒸水洗16）用2倍柱体积的再生缓冲液洗17）2倍柱体积的缓冲液平衡Ni-NTA树脂（18）将再生后的Ni-NTA树脂保存在20%的乙醇中注：其中乙醇洗涤的目的是由于其对脂蛋白、脂肪、疏水蛋白的去除效果较好，所以再生前需用不同浓度的乙醇洗柱EDTA可与金属镍离子螯合，从而去除镍，然后再用NiSO4进行挂镍专心---专注---专业。