mtDNACOⅡ基因序列应用于赤眼蜂分子鉴定的研究.docx

mtDNA COII基因序列应用于赤眼蜂分子鉴定的研究付海滨1丛斌I杜贤章$0沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110161； 2沈阳市农业科学院，沈阳110034)摘要：【目的】赤眼蜂(Trichogramma spp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广的一类卵寄生性天 敌，赤眼蜂蜂种的正确鉴别是取得良好防治效果的关键方法】 通过对松毛虫赤眼蜂(Trichogramma dendrol imi 玉米螟赤眼蜂(T. ostriniac\ 螟黄赤眼蜂(T. chi Ion is)、短管赤眼蜂(T. pret iosum)、卷蛾 赤眼蜂(T. cacoccia ) 5种赤眼蜂，及松毛虫赤眼蜂(T. dendrolimi )、玉米螟赤眼蜂(T. ostriniac)、螟黄 赤眼蜂(7： chi Ion is)的不同地理种群的细胞色素氧化酶II (mtDNA CO II)基因序列片段的测定，并调用GcnBank 中微小赤眼蜂7： minutum. T. plantncri的同源序列，对不同种赤眼蜂的mtDNA CO II序列进行了多重排比和聚 类，探讨了 mtDNA C0II用于赤眼蜂不同种系统进化分析及分子鉴定的可行性。

结果】序列分析结果表明，不同 地理种群赤眼蜂的遗传距离均小于0. 66%,不同种赤眼蜂间的遗传距离在2%~7.6%之间结论】C0II基因序列在 赤眼蜂种内非常保守，而种间存在明显的遗传差异，可以用作赤眼蜂种的分子鉴定关键词：赤眼蜂；mtDNA; C0II基因序列；分子鉴定；分子系统学Application of Mitochondrial Cytochrome Oxidase II (mtDNA CO II)to Molecular Identification of Trichogramma spp・FU Hai-bin1, CONG Bin1, DU Xian-zhang2(]College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161 ；AShenyang Academy of Agricultural Science, Shenyang 110034)Abstract: [Objective] Trichogramma spp・ is the most widely studied and used egg parasitoids for biological control of insect pests in the world. Correct Trichogramm species identification is the first step for a successful biological control program.【Method] The mitochondrial cytochrome oxidase II (mtDNA CO II) of five Trichogramma species, i.e. Trichogramma dendrolimi, T. ostriniae, T. chilonis, T. pretiosum, T. cacoeciae and different populations of T. dendrolimi, T. ostriniae, T. chi I on is were sequenced, and the homological sequences available in GenBank were retrieved for DNA alignment and clustering・ Research focused on feasibility of the application of CO II sequences to the phylogenetic and molecular identification of different Trichogramma species and different geographical populations of the same Trichogramma species・ 【Result] Alignment of sequenced CO II showed genetic distances were less than 0.66% with Trichogramma speices and 2%一7・6% between Trichogramma speices・ 【Conclusion】It can be concluded that COII gene sequences were highly conserved within intraspecific taxa, but significant genetic difference existed between interspecific taxa, and CO II is suitable for molecular identification at the species level.Key words： Trichogramma spp.; mtDNA; CO II sequence; Molecular identification; Molecular systematics0引言的一类卵寄生性天敌，广泛用于防治玉米、水稻、甘 蔗、棉花、蔬菜和松树的鳞翅冃害虫。

在农业害虫防【本研究的重耍意义】赤眼蜂^Trichogramma治的应用实践中，应用不同的赤眼蜂种控制不同的目 spp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广 标害虫是取得良好防治效果的关键前人研究进展】1971年Nagarkatti和Nagaraja发现具有种特异性状的 赤眼蜂雄牲外生殖器对赤眼蜂种类鉴定有了很人的改 善⑴，采用雄性外生殖器作为鉴别特征以來，赤眼蜂 的分类鉴定取得了迅速发展，近年來，随着分子生物 学技术的发展，国内外研究者曾用不同分子标记方法 來进行赤眼蜂近缘种的分子鉴别，黄寿山等利用同工 酶电泳技术对不同赤眼蜂进行鉴别⑵，Landry等利用 RAPD技术鉴别微小寄生蜂的遗传多态性⑶，李正西 和沈佐锐利用ITS2來研究赤眼蜂的系统发育并设计 出蜂种特异引物【本研究切入点】由于赤眼蜂形 体微小(1mm左右)，加上寄主所诱导的生理学和形 态学变异以及赤眼蜂存在的Wolbacia导致的产雌孤雌 生殖现象⑹，单靠雄件外生殖器对赤眼蜂种类鉴泄仍 然比较困难，几要求具有较高专业水平和实践经验， 非分类专家很难胜任，而每种分子标记也都有ft己的 不足，如：同工酶电泳由于实验所选的酶和蛋白质种 类有限，分析结果会带來一定的偏差，RAPD任意引 物的筛选较繁琐，木身存在操作的标准化和结果的可 帝复件问题，「DNA-ITS2不能区分缘系较近的赤眼蜂 种类QI,为此仍需寻找其他分子标记方法。

拟解决 的关键问题】本研究对來口国内外不同赤眼蜂种及同 种不同地理种群的线粒体细胞色素C氧化酶II(mtDNA CO 11 )基因进行测序，分析不同赤眼邺种 间、地理种群之间CO II序列的遗传分歧，探讨利用 CO II序列鉴定赤眼蜂的可行件，为赤眼蜂不同蜂种的 检测和鉴定技术提供科学依据1材料与方法1.1供试虫源松毛山赤眼蜂(T dendroiimi)＞玉米螟赤眼蜂(工 ostriniae)和螟黄赤眼蜂(T. chilonis)的广东广州(GZ) 品系以及短管赤眼蜂［7： pretiosum (引自美国)］由华 南农业人学昆虫系提供；松毛山赤眼蜂的北京(BJ) 品系，山北京市农林科学院生物防治科研中试基地王 素琴研究员提供；松毛虫赤眼蜂的辽宁沈阳(SY)和 辽宁岫岩(XY)品系以及玉米螟赤眼蜂的辽宁沈阳(SY)品系中沈阳农业大学害虫牛物防治研究室在出 间采集并经米蛾卵多代饲养；卷蛾赤眼蜂［T cacoeciae(引口徳国)］由农业科学院植物保护研究所土振 营博上提供；棉虫分索赤眼蜂(Trichogrammatoidea annigera)由印度牛物防治理事会Jalali博丄•提供所 有赤眼蜂都经室内饲养扩繁，条件为：温度25C,光 照 14 : 10h (L : D),湿度 70%〜80%。

1.2模板DNA的制备将10头赤眼蜂成虫置于冰冻1.5 ml离心管中， 每管加入100 |11提取裂解液(1%SDS, 10 mmol-L1 Tris-HCl, 25 mmol L-1 NaCb 25 mmol L-1 EDTA),用 封口枪头充分研磨匀浆，然后加4山蛋门酶K溶液(20 mg ml1), 56C温浴 3h 以上，然后 95C 10 min,离 心10 min (14 000 r/min),取上清液用酚/氯仿/异戊醇 (25 ： 24 ： 1)抽提 2 次，离心 10 min (14 000 r/min), 在上清液中加入0.2倍体积的乙酸钱溶液(10 mol-L-) 和2倍体积的无水乙醉，-20C过夜保存，然后离心 10 min (14 000 r/min),沉淀用预冷的70%乙醇洗涤, 沉淀室温下风干后溶于10卩1双蒸水中，-20C保存备 用1.3赤眼蜂CO II片段的特异扩增所用引物参照 Simon181 Forward:C2-J-3400, 5Z-AT TGGACATCAATGATATTGA-3f和 Reverse: C2-N3661, 5 ^-CC ACC A ATTTCTG AAC ATTG ACC A-3 ；扩 增片段 大小为300 bp左右。

在20 |il反应体积中进行PCR反 应,反应体系为:12.5 |il ddH2O, 2 pl 1 Ox buffer, 2 gl 25 mmol-L-1 MgCl2, 0.5 pl 10 mmol f1 dNTPs, 0.5 pl 20 gmol L-1的正向和反向引物，1U的Taq酶，1卩1 DNA模板在MJ-PTC200扩增仪上进行PCR扩增反 应，PCR程序为：首先在94C预变性4 min；然后94C 变性1 min, 55C退火1 min, 72C延伸1 min,扩增 35个循环;最后72C延伸7 min,置4C保存扩增 反应结束后，将PCR扩增产物在1%琼脂糖胶上进行 电泳分离，漠化乙锭(EB)染色，检测结果1.4 PCR产物的回收及测序在电泳中检测到冃标片段后，采用凝胶快速纯化 试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)冋收PCR产物, 每样收集50卩1,委托宝生物工程(大连)有限公司测 序为确保测序结果的准确性，在AB1 PRISM™ 377XL自动测序仪上进行双向测序1.5序列分析将所测得的COII序列在GcnBank中作BLAST 搜索，利用核酸序列分析软件DNAStar4.05对序列进 行排序剪裁，并将完整CO II序列提交到GcnBank注 册。

取自GenBank的参照序列及其登录号分别为： T.ininutum MBM ( AY232788 ), T. minutum MCD (AY232789 ), T. minutum MCB ( AY232790 ), T. minutum MBZ ( AY232791 ) , T. platneri PBG (AY232808), T. platneri PBE (AY232809), T. platneriPBD (AY232810), T. platneri PAY (AY232811)系 统进化分析所采用的序列代表赤眼蜂属不同种及不同 地理种群,外群采用棉虫分索赤眼蜂(AY963818)o 系统进化树的构建采用软件MEGA versio。