proteina、proteing与抗体的结合.pdf

Protein A 、Protein G 与抗体的结合 1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 目前，约 70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G 亲和层析蛋白 A (Protein A) 来源于金黄色葡 萄球菌的一个株系，它含有 5 个可以和抗体 IgG 分子的 Fc 段特异性结合的结构域蛋白 A 作为亲和配基 被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择 性，一步亲和层析就可达到超过 95%勺纯度1 个蛋白 A 分子至少可以结合 2 个 IgG蛋白 A 也可以结合另 一些免疫球蛋白，如用于某些种属的 IgA、IgM 的纯化 天然(Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于 IgG 的 Fc 段有着相似的特异结合重组的 蛋白 A 经改造后含有一个 C 末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上， 降低了空间位阻，增加了与 IgG 的结合能力蛋白 A 与 IgG 的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型， 而其动态结合能力则决定 于结合强度(解离常数)及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间 )。

2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 蛋白 G 是一种源自链球菌 G 族的细胞表面蛋白，为三型 Fc 受体其通过类似于蛋白 A 的非免疫机制与抗 体的 Fc 段结合像蛋白 A 一样，蛋白 G 可以与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的 IgG,多克隆 IgG 及人 IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高， 配基脱落也相对更低此外，蛋白 G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F (ab ')2 段结合 Protein G 是从 G 类 Streptococci 细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的 IgG Fc 段结合(包括： 人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDaProtein G 可用于纯化不能与 Protein A 很好结合的哺乳动物单抗和多抗 IgG 的纯化相对于 Protein A , Protein G 对于大多数哺乳动物的 IgG 有着更高的亲和力， 尤其是对于 IgG 的亚基，如人 IgG3，小鼠 lgG1 和鼠 IgG2a。

与 Protein A 不同，Protein G 不与狗 IgG 结合、不结合人 IgM, IgD，或 IgA 重组蛋白 G(RecombProtein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性 结合因此，它比天然蛋白 G 和蛋白 A 有更大的亲和力可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域在 亲和力、稳定性等方面好 本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白 G 偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶 6B 上，成为用于抗体分 离纯化的亲和层析介质本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体 由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好 的效果并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少 亲和介质特性 特点 基团脱落少，结合特异性强 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 配基 重组蛋白 G 配基密度 ~6mg 重组蛋白 G/ml 吸附载量 3-7mg 鼠 lgG2a/ml 亲和介质的颗粒大小 50- 160 gm 最大流速 200cm/h pH 范围 3-10，在位清洗时 pH 范围可到 2-11 使用温度 常温 保存温度 +4~8° C 保存液体 20%乙醇 三、适用范围 Protein A 和 Protein G 的相对结合强度 物种物种 亚类亚类 protein A 结合 protein G 结合 人 lgA 可变 - lgD - - lgD - - lgG1 ++++ ++++ lgG2 ++++ ++++ lgG3 - ++++ lgG4 ++++ ++++ lgM 可变 - 鸡蛋黄 lgY 牛 ++ ++++ 狗 ++ + 山羊 - ++ 豚鼠 lgG1 +++ ++ lgG2 +++ ++ 仓鼠 + ++ 马 ++ ++++ 考拉 - + 骆驼 - + 猴(恒河) ++++ ++++ 小鼠 lgG1 + ++++ lgG2a ++++ ++++ lgG2b +++ +++ lgG3 ++ +++ lgM 可变 - 猪 +++ +++ 兔 ++++ +++ 大鼠 lgG1 - + lgG2a - ++++ lgG2b - ++ lgG3 - ++ 绵羊 +/- ++ ++++ =强结合，++ =中等结合，-=弱或不结 四、缓冲液配制 建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。

A 缓冲液 1mol/L ........................... 1500 mM NaCl lmol) ............................ 溶于 1 升水，滤膜过滤 B 缓冲液 1mol/L NaH2P04 ................................. 1500 mM NaCl lmol) ......................... 溶于 1 升水，滤膜过滤 C 吸附和洗涤缓冲液 根据所需 PH 值，按下表 3 配制按照所列比例量取后混合，然后 再加 9 倍体积的水，稀释成应用溶 液 如果洗脱下的抗体有些杂带，可加吐温 -20 至终浓度% D 中和缓冲液：A 液、B 液；两液混合成的中和缓冲液 E 洗脱液 L NaH2P04 ............................................. 150 mM NaCl Imol） ............................... 溶于 1 升水，滤膜过滤，HCI 调整 PH 至 五、应用举例 A 实验名称：从小鼠腹水中分离纯化 lgG2a 1、 重组蛋白 G 琼脂糖凝胶装柱，柱床体积为 1ml，流尽 20%乙醇溶液； 2、 以缓冲液 C 平衡 5-10 个床体积，流速为 1ml/min ;（缓冲液 C 配制方法：取 A 液、B 液，再加 900ml 水，混合后）• 3、 将小鼠腹水用缓冲液 C 稀释到 2ml，卩 m 滤膜过滤，上样。

流速为 1ml/min ; 4、 用缓冲液 C 再洗 5-10 个床体积，流速为 1ml/min ; 5、 用洗脱液 E,洗脱 3 体积 6、 在洗脱液加入体积中和缓冲液，以 PH 试纸确认溶液为中性溶液太酸，会损伤抗体活性（中和缓冲液 配制方法：A 液、B 液；两液混合成的中和缓冲液 7、 将分离纯化的 lgG2a 与对照品同时进行 SDS-PAGE 电泳分析 8、 用纯水流洗 10 个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗 10 个柱床体积，流速为 2ml/min , 柱子置于+4~8C环境中保存 表三，25E下 L 磷酸钠缓冲液的配制 A 液 B 液 pH 1mol/L Na 2HPO(ml) 1mol/L NaH2PO(ml) 根据比例量取混合，然后在加 9 倍体积的水，稀释成应用溶液 B 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP） : （1）蛋白样品的准备： 1）对于 10 厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液， PBS 洗涤一次，然后加入 500 微升至 2 毫升 细胞裂解液裂解细胞 3） 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解 4） 对于悬浮细胞，离心收集细胞后， PBS 洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注： 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法对于不同的培养器材，参考 解液的用量进行裂解如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或 PBS 适当稀释，如果蛋白样品 浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量 （2）. 去除非特异性结合 （ 可选做 ）： 1） . 取 200 微升至 1 毫升蛋白样品，蛋白量约为 200 微克至 1 毫克，加入约 1 微克和免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通 IgG 和 20 微升充分重悬的 Protein A+G Agarose , 4 C缓慢摇动 30 分钟至 2 小时 2） . 2500rpm（约 1000g）离心 5 分钟，取上清用于后续的免疫沉淀 注：所谓种属相同的 IgG 是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠 IgG，则在本步骤中可以加入 normal mouse IgG，如无 normal IgG 可以加入其它不影响后续检测的其它 mouse IgG 类型的抗体通过和 normal IgG 和 Protein A+GAgarose 的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景 （ 3） . 免疫沉淀： 1） .加入微克用于免疫沉淀的一抗， 4C缓慢摇动过夜。

2） .再加入 20 微升充分重悬的 Protein A+G Agarose , 4C缓慢摇动 1-3 个小时为方便后续的洗涤操 作可以把加入充分重悬的 Protein A+G Agarose 的量调整为 40 微升 ） 3） . 2500rpm（约 1000g）离心 5 分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸 掉 Protein A+GAgarose 4） .用准备蛋白样品时的裂解液或 PBS 洗涤沉淀 5 次，裂解液或 PBS 的用量每次为毫升洗涤时离心条 件和吸除上清的要求同上面的步骤 C3 5） .完成最后一次洗涤后，去除上清，加入 20-40 微升 1XSDS-PAG 电泳上样缓冲液 Vortex 重悬沉淀， 瞬时高速离心把样品离心至管底 6） . 100 C或沸水浴处理 3-5 分钟，取部分或全部样品用于 SDS-PAG 电泳，暂时不用的样品可以 -20 C保 存 10 厘米培养皿的裂 。