散射光和拉曼光的影响及消除ppt课件.ppt

3 散射光和拉曼光的影响及消除 n蕾莱 瑞利 Rayleigh scattering light 散射光 光子和物质分子碰撞 时 未发生能量交换 仅运动方向发生 改变 其波长和入射光波长相同 这种 散射光叫做瑞利散色光 n发射光波长与激发光波几乎相等 由溶 剂 容器 胶体等散射引起 距离荧光 峰较远 只要选择适当的波长 由单色 器消除 1 3 散射光和拉曼光的影响及消除 n拉曼散射光Raman scattering light 光子和物质分子碰撞时 在 光子运动方向发生改变的同时 将部分能 量转给物质分子或从物质分子得到能量 均使光子能量发生改变 前者使光子能量 减少 波长比入射光更长 后者使光子能 量增加 波长比入射光要短 这两种光均 称为拉曼散色光 n发射光波长与荧光波长相近 即与荧光峰 靠近 难区别 由空白溶剂产生 2 3 散射光和拉曼光的影响及消除 n消除方法 因为荧光波长不随激发光的 改变而改变 而拉曼散射光随激发光改 变而改变 所以 只要采用波长较短的 激发光进行激发 就可避免干扰 n例如 硫酸喹啉及其溶剂 硫酸溶液 在不同波长激发下的散射光 3 3 散射光和拉曼光的影响及消除 350 荧光 448 350 拉曼 400 320 拉曼 360 320 荧光 448 拉曼 360 溶剂的激发光谱 拉 曼散射 硫酸喹啉及其溶剂 硫酸溶液 在不同波 长激发下的光谱 320nm激发 350nm激发 4 3 散射光和拉曼光的影响及消除 n硫酸喹啉分别用320nm 350nm激发时的 荧光光谱 n320nm激发 拉曼光在360nm 对荧光 448nm 无影响 350nm激发 拉曼光在 400nm 与荧光 448nm 叠加 产生干 扰 因此 采用波长较短的激发光 320nm 进行激发 就可避免拉曼光的干 扰 5 第二节 分子荧光光谱仪 荧光计 荧光分光光度计基本结构相似 仪器基本结构 由激发光源 样品池 用于选择激发光波长和荧光波长的单色 器 检测器及记录仪组成 6 荧光光谱仪 激发单色器 或滤光片 记录仪 发射单色器 或滤光片 荧光 光源 激发 样品池 检测器 7 仪器测量基本原理 n由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发光波长 通过样品池后 一部分光能被荧光物质所吸收 荧 光物质被激发后 发射荧光 可以在溶液的各个方向 观察到荧光 但由于激发光一部分可透过溶液 为了 消除入射光和散射光的影响 荧光的测量通常在与激 发光成直角的方向上进行 n为消除可能共存的其它光线的干扰 如由激发所产生 的反射光 Raman光以及为将溶液中杂质滤去 以获得 所需的荧光 在样品池和检测器之间设置了发射单色 器 荧光作用于检测器上 得到响应的电信号 n注意荧光测量方向 8 1 光源 在紫外 可见区范围 通常的光源是 荧光计用溴钨灯或高压汞灯 荧光分光光度计用氙弧灯 连续光 源 可用于200 700nm 在300 400nm 光谱强度几乎相等 新型激发光源 高功率连续可调染料 激光光源 9 2 单色器 激发单色器 第一单色器 在光源和样品池之 间 滤去非特征波长的激发光 发射单色器 第二单色器 在样品池和检测器 之间设置 为消除可能共存的其它光线的干扰 如由激发所产生的反射光 Raman光以及将溶液 中杂质滤去 以获得所需的荧光 荧光计用滤光片作单色器 分光能力差 荧光分光光度计用棱镜或光栅作单色器 分光能力 强 10 3 样品池 n荧光用的样品池须用低荧光的材料制成 四面透光 通常用石英 形状以方形 和长方形为宜 11 4 检测器 n荧光计用光电池或光电管 荧光分光光 度计用光电倍增管作检测器 并与激发 光成直角 12 第三节 分子荧光光谱法的应用 一 定性分析 二 定量分析 三 其他应用 13 分析方法的特点 n 灵敏度高 视不同物质 检测下限在0 1 0 001 g mL之间 比UV Vis的灵敏度高得多 WHY n 选择性好 可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性 n 试样量少和方法简单 n结构信息量多 包括物质激发光谱 发射光谱 光强 荧光量子效率 荧光寿命等 n 应用不广泛 主要是因为能发荧光的物质不具普遍性 增强荧光的方法有限 外界环境对荧光量子效率影 响大 干扰测量的因素较多 14 一 定性分析 n任何荧 磷 光都具有两种特征光谱 激发光谱与发射光谱 它们是荧 磷 光定性分析的基础 n定性鉴定物质的可靠性较紫外可见光谱 更强 但定性必须有标准物质在同样条 件下对照 15 二 定量分析 n荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产 率 nIf Ia n 式中 为荧光量子效率 又根据Beer定律 nIa I0 I I0 1 10 b C n I0和I分别是入射光强度和透射光强度 代 入上式得 1 荧光强度与溶液浓度的关系 16 1 荧光强度与溶液浓度的关系 nIf I0 1 10 b c nIf I0 1 e 2 303 bc nTaylor展开 n当 lc 0 05时 If 2 303 I0 bc n当入射光强度I0 和b一定时 上式为 If kc 17 1 荧光强度与溶液浓度的关系 n 即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比 作为荧光定量分析的依据 n但这种线性关系只有在极稀的溶液中 当 bc 0 05时才成立 对于较浓溶液 由于 猝灭现象和自吸收等原因 使荧光强度和 浓度不呈线性关系 n If 2 303 I0 bc n提高入射光强度I0 有利于提高灵敏度 改变量子产率 有利于提高灵敏度 当 增加 荧光强度If增加 18 1 荧光强度与溶液浓度的关系 n 对于较浓溶液 由于猝灭现象和自吸 收等原因 使荧光强度和浓度不呈线性 关系 这种弯曲 随着样品池厚度的增 加而出现得更早 19 荧光光度法的灵敏度比紫外可见 光度法高的原因 1 增大光源强度 可提高荧光测定的灵 敏度 而不能提高紫外 可见分光光度法 的灵敏度 2 荧光光度法直接测定发射荧光的强度 荧光强度大 信号强 而紫外可见光 度法测定吸收光前后的强度变化 吸光 度 信号弱 20 荧光光度法的选择性比紫外可见 光度法高的原因 荧光光谱有激发光谱和发射光谱 能吸收光的物质不一定都能发荧光 不同 物质吸收某一相同波长的光后所发射的 荧光波长也不尽相同 21 标准荧光物质 作荧光强度测量时 标准荧光物质的作用是 什么 如何进行测量的 答 作荧光强度测量时 标准荧光物质的作 用是校正仪器 用标准荧光物质把仪器读 数定位到某个值 以此为标准 测定空白 溶液 标准溶液及样品溶液的 相对 荧 光强度 使标准样和样品溶液有一较好的 读数 22 2 单组分的荧光直接测定和间接测 定 直接测定 被测物发荧光 间接测定 利用化学反应使非荧光物质转 变为能用于测定的荧光物质 荧光猝灭法 利用某物质使荧光化合物的 荧光降低来进行测定 如对氟 硫 铁 银等的测定 23 应用于 n无机化合物 n有机化合物 定量方法 当 lc 0 05时 If 2 303 I0 bc n当入射光强度I0 和b一定时 上式为 If kc 标准曲线法 直接比较法求出被测物浓度 2 单组分的荧光直接测定和间接 测定 24 3 多组分的荧光测定 n由于有激发和发射波长可分别选择 因 此选择性也较好 方法灵敏度比吸收光 度法高1 3数量级 25 三 其他应用 自学 激光诱导荧光分析法具有超高灵敏度 可 应用于生物大分子的分析 1 溶液中单分子行为的研究 2 基因研究及检测 26 第四节 磷光光谱法 与荧光相比 磷光具有如下三个特点 1 磷光辐射的波长比荧光长 分子的T1态能量比S1态低 2 磷光的寿命比荧光长 由于荧光是S1 S0跃迁产生的 这种跃迁是 自旋许可的跃迁 因而S1态的辐射寿命通常在10 7 10 9s 磷光是T1 S0跃迁产生的 这种跃迁 属自旋禁阻的跃迁 其速率常数要小 因而辐射 寿命要长 大约为10 4 10s 3 磷光的寿命和辐射强度对于重原子和顺磁性离 子敏感 27 一 低温磷光 n低温磷光分析中 液氮是最常用的合适 的冷却剂 因此要求所使用的溶剂 在 液氮温度 77K 下应具有足够的粘度并 能形成透明的刚性玻璃体 对所分析的 试样应具有良好的溶解特性 试样的刚 性可减少磷光的碰撞猝灭 28 一 低温磷光 n溶剂的选择 溶剂应易于提纯 以除去 芳香族和杂环化合物等杂质 溶剂应在 所研究的光谱区域内没有很强的吸收和 发射 最常用的溶剂是EPA 它由乙醇 异戊烷和二乙醚按体积比为2 5 5混合 而成 使用含有重原子的混合溶剂IEPA 由EPA 碘甲烷 10 1组成 有利于 系间跨越跃迁 可以增加磷光效应 29 二 室温磷光 n由于低温磷光需要低温实验装置 溶剂 选择的限制等因素 从而发展了多种室 温磷光法 30 固体基质室温磷光法 n 此法基于测量室温下吸附于固体基质上的 有机化合物所发射的磷光 n所用的载体种类较多 有纤维素载体 如 滤纸 玻璃纤维 无机载体 如硅胶 氧化铝 以及有机载体 如乙酸钠 聚合 物 纤维素膜 等 理想的载体是既能将 分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增 加其刚性 并能减小三重态的碰撞猝灭等 非辐射去活化过程 而本身又不产生磷光 背景 31 胶束增稳的溶液室温磷光法 n当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶束浓 度后 便相互聚集形成胶束 由于这种胶束 的多相性 改变了磷光团的微环境和定向的 约束力 从而强烈影响了磷光团的物理性质 减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去 活化过程的趋势 明显增加了三重态的稳定 性 从而可以实现在溶液中测量室温磷光 利用胶束稳定的因素 结合重原子效应 并 对溶液除氧 是该法的三个要素 32 三 磷光分析仪 n磷光分析仪与荧光分析仪相似 在荧光分光光度计上 配上磷光配件后 即可用于磷光测定 1 样品池 如将样品放在盛有液氮的石英杜瓦瓶 内 即可用于低温磷光测定 2 可转动的斩波片或圆柱形筒 在激发光单色器 和样品池之间 样品池和发射光单色器之间 各装一 个斩波片 并由一个同步电动机带动 这两个斩波片 可调节为同相或异相 同相时 磷光和荧光一起进入 发射光单色器 测得的是两者总光强 当斩波器调节 为异相时 激发光被遮断 此时 荧光的寿命短 立 即消失 磷光寿命长 所测到的仅为磷光 具有时间 分辨功能 33 三 磷光分析仪 可转动的圆柱形筒可转动的斩波片 34 四 应用 n磷光强度与浓度的关系 nIp 2 303 p I0 bc n p 磷光量子效率 nIp也只有在低浓度时 才与浓度c成线性关 系 但磷光的浓度线性范围要比荧光大 n磷光分析主要用于测定有机化合物 如石 油产品 多环芳烃 农药 药物等方面 35 第五节 化学发光与生物发光 分析 n 某些物质在进行化学反应时 由于吸收了 反应时产生的化学能 而使反应产物分子激 发至激发态 受激分子由激发态回到基态时 便发出一定波长的光 这种吸收化学能使 分子发光的过程称为化学发光 n利用化学发光反应而建立起来的分析方法称 为化学发光分析法 n化学发光也发生于生命体系 这种发光称为 生物发光 如萤火虫 某些细菌 真菌 原 生动物 蠕虫以及甲壳动物等所发射的光 36 一 化学发光分析的基本原理 n化学发光是吸收化学反应过程产生的化 学能 而使反应产物分子激发所发射的 光 n任何一个化学发光反应都应包括化学激 发和发光两个步骤 必须满足如下条件 37 化学发光必须满足如下条件 1 化学反应必须提供足够的激发能 激发 能主要来源于反应焓 大多数化学发光反 应为氧化还原反应 2 要有有利的化学反应历程 使化学反应 的能量至少能被一种物质所接受并生成激发 态 3 发光效率高 激发态能释放光子或能够 转移它的能量给另一个分子 而使该分子激 发 然后以辐射光子的形式回到基态 38 化学发光效率 cl n化学发光效率 cl 又称化学发光的总量子 产率 它决定于生成激发态产物分子的化学 效率 r和激发态分子的发光效率 f 定义 为 n cl 发射光子的分子数 参加反应的分子 数 r f 39 二 化学发光反应类型 1 直接化学发光 。