生物化学实验讲义——生工10.doc

实验一 蛋白质的两性性质及等电点的测定 一 实验目的通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系二 实验原理蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质蛋白质分子中可以解离的基团除末端a－氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a－羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（pI）在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。

本实验采用酪蛋白在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH值为该种蛋白质的等电点三 实验设备(1) 试管架 1个 (2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支(3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支 四 实验试剂（1）1mol/L醋酸溶液：量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL，加水至50 mL2）0.1mol/L醋酸溶液：量取1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL3）0.01mol/L醋酸溶液：量取0.1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL （4）0.2mol/L氢氧化钠溶液：先称取氢氧化钠（分析纯）2g，加水至50 mL，配成1mol/L氢氧化钠然后量取1mol/L氢氧化钠10 mL，加水至50 mL，配制成0.2mol/L氢氧化钠5）0.2mol/L盐酸溶液：先量取37.2%盐酸（比重1.19）4.17 mL，加水至50 mL，配成1mol/L盐酸然后量取1mol/L的盐酸10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L盐酸6）0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g、加0.29 mL 1mol/L氢氧化钠，然后加水至50 mL。

7）0.5%酪蛋白溶液：称取纯净酪蛋白0.25g放入50 mL容量瓶内，加水约20 mL，再准确加入1mol/L氢氧化钠5 mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L醋酸5 mL，最后加水稀释至50 mL，充分摇匀注：氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定五 操作步骤1、蛋白质的两性反应（1）取两支试管，加0.5%酪蛋白2 mL，再加溴甲酚绿指示剂4-5滴，摇匀此时溶液呈兰色，无沉淀生成，说明了什么？（2）用滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，随加随摇直至有明显大量的沉淀生成，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点，观察溶液颜色有何变化？（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少消失观察此时溶液的颜色有何变化，说明什么？（4）滴加0.2mol/L氢氧化钠进行中和，沉淀又出现继续滴加0.2mol/L氢氧化钠液，沉淀又逐渐消失，从溶液的颜色变化说明什么？注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8-5.42、蛋白质等电点的测定取5支试管依次标号，按下列表格添加试剂，立即摇匀，观察混浊度各管混浊度以-、±、+、++、+++表示指出酪蛋白的等电点 编号试剂123450.5%酪蛋白（mL）蒸馏水（mL）0.01mol/L醋酸（mL）0.1mol/L醋酸（mL）1mol/L醋酸（mL）pH1.008.380.62——5.91.008.75—0.25—5.31.008.00—1.00—4.71.005.00—4.00—4.11.007.40——1.603.5观察0分钟5分钟后六 实验结果 1、解释上述实验反应的现象2、指出酪蛋白的等电点实验二 总糖的测定——蒽酮比色法一 实验目的1、学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。

2、学习722型分光光度计的原理和操作方法二 实验原理 ·总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与葸酮(C14H10O)缩合成蓝色化合物溶液含糖量在每mL l50 μg 以内，与葸酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必经过水解三 实验器材1、试管(或具塞试管) 15 ～20mL 11支 2、吸管 (1 mL 3支、10 mL 1支) 3、试管架 1个 4、水浴锅 5、722型分光光度计 6、漏斗 1个7、50mL锥形瓶 1个 8、移液管架 1个9、50mL容量瓶 2个 10、25mL量筒 1个11、水稻芽四、试剂和材料1、蒽酮试剂 1 000 mL称取1.00g蒽酮溶于1000 mL 98％硫酸溶液(A．R)中，用时配制。

2、葡萄糖标准溶液(250μg/mL) 500 mL 精确称取125mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至500 mL3、样品溶液 300 mL可自选待测物制成样品溶液五 实验操作取新发的水稻芽用剪刀剪碎（2cm以内），称取1g，放入50 mL锥形瓶中，加入25mL沸水，在水浴中加盖（小漏斗）保持沸腾20分钟，冷却至室温后过滤，滤液收集于50mL容量瓶中，水洗三角瓶及残渣，合并滤液，定容至刻度，摇匀，得提取液吸取提取液5mL，置于另一25mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀为待测液1、制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作 编号试剂（mL）1234567葡萄糖标准液（250μg /mL）H2O蒽酮试剂 01.010 0.100.9010 0.200.8010 0.400.6010 0.600.4010 0.800.2010 1.00.010每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂①后，同时置于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出，置冰浴中迅速冷却待各管溶液达室温后，用1 cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的吸收值。

然后以第2管～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度(A620nm)为纵坐标，画出含糖量与A620nm值的相关标准曲线2、测定样品的含糖量 取4支试管按下表操作编号试剂（mL）1234样品溶液H2O蒽酮试剂01.010.01.0010.01.0010.01.0010.0其他操作与制作标准曲线相同将2管～4管测出的A620nm平均值，根据A620nm平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，再换算成100g样品中总糖的含量思考题用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么?为什么?实验三 氨基酸的分离鉴定——纸层析法一 实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法二 实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法层析溶剂由有机溶剂和水组成物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的：在一定的条件下某种物质的Rf值是常数Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关本实验利用纸层析法分离氨基酸三 实验器材1、层析缸（1个） 2、毛细管（6根） 3、喷雾器 （1个） 4、培养皿（1个） 5、层析滤纸(新华一号) 6、针线，铅笔，直尺，剪刀 7、烘箱四 实验试剂1、扩展剂 650mL是4份水饱和的正丁醇和1份冰醋酸的混合物。

将20 mL正丁醇和5 mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15 mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用2、氨基酸溶液 0.5％的L-丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5％)各5 mL3、显色剂　0.1％水合茚三酮正丁醇溶液 50~100mL五 实验操作1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中2、取层析滤纸(长13 cm、宽11.5 cm)一张在纸的一端距边缘2 cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2 cm和1.5 cm作一记号如下图 3、点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次每点在纸上扩散的直径最大不超过２ mm4、扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)待溶剂上升9~10 cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干5、显色 用喷雾器均匀喷上0.1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6、量出各点的距离六 实验结果计算各种氨基酸的Rf值，指出混和氨基酸中含有哪些单一的氨基酸思考题1、何谓纸层析法?2、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ ．3、怎样制备扩展剂?4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验四 淀粉酶活性的测定一 实验目的本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法二 实验原理植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖淀粉酶几乎存在于所有植物中有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一。