凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析.docx

实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1. 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术2. 掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技 能与含氮量的计算二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H 形成C02、H20逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸 铵留在酸液中然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸 出，用硼酸吸收吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的 硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白 含量2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 = (NH4)2 S04 + 6CO2f+ 12SO2f + 16H2O(NH4)2 SO4 + 2NaOH = 2NH3f + Na2SO4 + 2H2O2NH3 + 4H3B03 = (NH4)2 B407 + 5H20(NH4)2 B407 + 2HCl + 5H20 = 2NH4Cl + 4H3B03三、 样品：面粉四、 仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。

1. 消化试剂：浓 H2SO4 硫酸铜（固体） 硫酸钾（固体）2. 2%硼酸（H3BO3）溶液：10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用二组配500ml3. 40%NaOH溶液准确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，包好，塞入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuS04、6g K2SO4及25mL浓硫酸，加数粒玻璃珠，轻轻摇匀后， 用电炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色 透明后，再继续加热微沸30分钟为了加快消化速度，待泡沫消失后，可添加双氧水，每次加 4-5ml注意，每次添加双氧水时，就从热源上取下定氮瓶，待消化液冷 却至70-80C后，方可加入30%浓度的双氧水取 50~60mL 蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至 室温，移入 250mL 的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容 量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）2、蒸馏与吸收：⑴组装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红 指示液数滴及数毫升硫酸（呈黄色），以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠 以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

⑵将所有的夹子打开取下样品加入口的磨口塞，从样品加入口 加入50mL的蒸馏水，再插回塞好，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应 室，蒸馏洗涤10分钟然后排出废水马上从进样口加入蒸馏水约 20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕⑶量取25mL2%硼酸置于250mL锥形瓶内，并加入2滴混合指 示剂，然后将此吸收液置于冷凝管下端插入到液面以下⑷将全部夹子打开，用移液管准确吸取10.0ml样品消化稀释液 (或空白液)，从样品加入口流入反应室内，用少量水(10ml)洗涤加 入口，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小 玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，使反应室内的样液呈碱 性，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防止氨的逸出⑸夹紧螺旋夹，开始蒸馏从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离 液面,再蒸馏 1 分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收 液内，取下接收瓶6)反复洗涤反应室后，再作样品平行测定测定完毕，打开全 部夹子，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净3．滴定：用0.0100mol/L HCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的 HCl 体积。

平行实验进行数次同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按上述操作做试剂空白试验注意：定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗 涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作洗净的标志：吸收液不变颜色四、计算：公式自己推导蛋白质% =C — HCI标准溶液的浓度，mol/L；V1—滴定样品吸收液消耗的HCI标准溶液的体积，mL；V2—滴定样品空白液消耗的HCI标准溶液的体积，mL；m —面粉的质量， g ；0.01401 －氮的毫摩尔质量；F —小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70说明：参见书中 P222六、注意事项：1 ）所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制2) 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内 壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失3) 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入 30%过氧化氢2~3mL后再继续加热消化4) 蒸馏装置不能漏气5) 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀， 此时需再增加氢氧化钠用量6) 硼酸吸收液的温度不应超过40C,否则对氨的吸收作用减弱 而造成损失，此时可置于冷水浴中使用以硼酸为氨的吸收液，可省 去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液 管,操作比较简便。

7)蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面清洗管口,再蒸1min 后关掉热源,否则可能造成吸收液倒吸 8)在蒸馏时,蒸汽发生要均匀充足,蒸馏过程中不得停火断 汽,否则将发生倒吸9)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性 溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色4. 0.0100mol/L 盐酸标准溶液5.混合指示剂：临用时，把溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液 10毫升和溶于95%乙醇的0.1%甲基红溶液2毫升混合而成（比例5：1）．（公用）五、测定方法1 、样品消化：。