（新编）水中大肠菌群的测定.doc

水中大肠菌群的测定报告题目 水中大肠菌群的测定作者姓名班级 生科 1104 班指导教师完成时间 2013 年 6 月生物学实验教学中心综合实验：题目目 录引言 ...............................................................................................................11 实验材料 .................................................................................................12 实验步骤 .................................................................................................12.1 ..............................................................................................................12.2 ..............................................................................................................12.3 ..............................................................................................................12.4 ..............................................................................................................12.5 数据分析与结果处理 .........................................................................13 结果与分析 .............................................................................................13.1 图片 .....................................................................................................13.2 ..............................................................................................................1总结 ...............................................................................................................1参考文献 .......................................................................................................1综合实验：题目水中大肠菌群的测定（指导老师：）（湖北师范学院生命科学学院 生物技术 1104 班 湖北 黄石 435002）摘 要：测定青山湖水中的大肠菌群的含量。

将待测水分别稀释 10 倍、100 倍、1000倍 3 种梯度在三倍浓缩培养基 37℃培养 24h 后挑选出产酸或产气的菌画线接种到伊红美蓝平板中 37℃培养 24h，将培养基中表现为阳性的菌落做革兰氏染色镜检为阴性的菌种接种到乳糖蛋白胨培养基中 37℃培养 24h,挑选大肠杆菌阳性菌结果稀释 10 倍的水有 3 管大肠杆菌阳性菌，稀释 100 倍的水有 3 管，稀释 1000 倍的有 2 管，即青山湖水中大肠杆菌的含量为MPN=11000.关键词：大肠杆菌、多管发酵法 青山湖水水中大肠菌群的测定（指导老师：）（湖北师范学院生命科学学院 生物技术 1104 班 湖北 黄石 435002）引言水对我们的生命起着重要的作用，它是生命的源泉，是人类赖以生存与发展的不可缺少的最重要的物质资源之一人的生命一刻也离不开水，水是人生命需要最主要的物质水也是大肠菌群的天然环境，一般地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污染人饮用后引发疾病水质细菌学检验是培水与污水水质分析工作中的一项重要指标水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。

国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过 3 个，细菌总数每毫升不超过 100 个1 实验材料药品：蛋白胨，牛肉膏，乳糖，蒸馏水，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，2%伊红（曙红）水溶液，0.5%美蓝（亚甲蓝）水溶液，氢氧化钠水溶液工业酒精、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液，番红复染液，香柏油，二甲苯仪器(生产厂家)：显微镜，天平，培养箱，水浴锅，平皿，德氏管，刻度吸管，洗耳球，无菌涂布棒，量筒，灭菌锅，酒精灯，接种环，棉花，棉线，报纸菌种：青山湖水中大肠杆菌2 实验步骤（参照实验书）：2.1 配制培养基及灭菌1. 乳糖蛋白胨培养基的配制（供多管发酵法的复发酵用）（1）蛋白胨 1g牛肉膏 0.5g乳糖 0.5g氯化钠 0.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 0.1mL蒸馏水 100mL2、三倍浓缩乳糖培养基（1）蛋白胨 3g牛肉膏 1.5g乳糖 1.5g氯化钠 1.5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 0.3mL蒸馏水 100mL3.灭菌 移液管的包装：将移液管的尖端，放在 4-5cm 宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成 30°夹角，折叠包装纸包住移液管尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结。

多支包装，待灭菌 培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用报纸将 10 套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，5 套、5 套相对而放）包好 棉塞的制作：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中间厚、周围逐渐变薄的近正方形，折一个角后（成五角形）卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过紧或过松用手提棉塞，以管、瓶不掉下为宜棉塞四周应紧贴管壁或瓶壁不能有褶皱，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入棉塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约 3/5 塞入管内必须做到松紧合适，紧贴管壁，拔出时不松散、不变形 将所有准备待灭菌物品，包扎好后置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min 将上述灭菌物品贮存于冷暗处备用1.2 初发酵实验配制 350ml 三倍的乳糖蛋白胨培养液（每组取 45ml） ，分装到 9 支试管中，每支试管内加入一个倒放的布氏小管，保证小管内无气泡取水样并作梯度稀释，分别稀释出 10倍，100 倍，1000 倍，在培养基中加入 3 中浓度的菌液 10ml，每个稀释浓度各重复 3个，混匀 37 度培养 24h2.3 平板分离培养后产酸，产气或仅产酸的发酵管为阳性反应，否则为阴性。

配制伊红美蓝培养液1200ml（每组取 200ml） ，然后倒 12 个平板，分别将 9 支试管中的菌用画线法接种到培养基上， 再随机从 3 种浓度的菌液中随机取一管进行接种37 度培养 24h将培养基中的菌种挑取少许进行革兰氏染色，再做镜检革兰氏染色：将带有上述典型特征的菌落（在伊红美蓝平板上大肠杆菌群的典型菌落为深紫黑色，具有金属光泽；或者为紫黑色，不带或略带金属光泽；或者为紫红色、中心较深的菌落）做革兰氏镜检：将大肠杆菌菌落涂片，干燥，固定然后加草酸铵结晶紫一滴，染色 1 分钟后倾去染液，水洗至流出水为无色用卢戈氏碘液覆盖 1 分钟，倾去碘液，水洗至流出水为无色再用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，并衬以白纸背景，用 95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，25S，然后立即用水冲去乙醇将玻片上残留的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色 2 分钟，水洗，吸去残水，晾干干燥后，油镜观察以分开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色阴性菌呈红色2.4 复发酵配制 100ml 乳糖蛋白胨培养基，分装 10 管（每管均加入布氏小管） ，高温灭菌将镜检结果为阴性的菌种对应的培养基上的菌种接种到乳糖蛋白胨培养基上，37 度培养24h，仍产酸，产气的是大肠菌群阳性。

2.5 结果计算根据三个稀释度中的阳性管数组成的一个数量指标，查表计算结果3 结果与分析1.大肠杆菌初发酵后的实验现象：稀释度0.1 0.01 0.001管号 1 2 3 1 2 3 1 2 3现象 气泡较多，溶液变黄有气泡，溶液变黄有气泡，溶液变黄有气泡，溶液变黄气泡较少，溶液变黄2. 伊红美蓝培养基的筛选后的实验现象： 稀释度 0.10.01 0.001管号 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4镜检现象阴 阴 阴 阴 阴 阴 阴 阴 阳 4 阴 阴 阴3.大肠杆菌复发酵的实验现象：稀释度 0.1 0.01 0.001阳性管数 3 3 2大肠杆菌 MPN 11000实验分析：大肠杆菌是一大类群的总称并不是哪一种的种名，这一类群中包括好多种，这些种中有的仅产酸有的既产酸又产气大肠杆菌在伊红美蓝中菌落具有典型的特征，依据菌落的特征可以进行筛选再由革兰氏染色进行确认本次实验中初发酵中现象均为阳性，在进行筛选中有 6 个培养皿中镜检为阴性，但镜检中发现大肠杆菌的密度很低在复发酵的实验结果中培养一天各管并未产气且仅有一管产酸，可能是复发酵挑选的菌中大部分不是大肠杆菌，也有可能是菌浓度过低，还有可能是在挑菌是挑的太少或是在操作时不规范如在灼烧接种环时未待冷却使菌受到损伤或直接烧死了，这些均会是结果不理想。

总结释 10 倍的水有 3 管大肠杆菌阳性菌，稀释 100 倍的水有 3 管，稀释 1000 倍的有 2管即青山湖水中大肠杆菌的含量为 MPN=11000.实验内容与安排的建议、实验感受、实验改进想法等操作分析1、培养基的配制灭菌1）在培养基分装过程中注意乳糖培养基与三倍乳糖培养基的量，其中三倍乳糖培养基是每管 10ml,乳糖培养基每管 5ml2）杜氏小管在倾斜的放入装有培养基的试管内出现了气泡，将试管倒立使气泡排空后再正放即可排除气泡3）在整理所需灭菌物品时，由于训练不足整体上还是有点混乱，不过能及时解决4）培养基的配制仪器的包扎与包装比较熟练，未出现问题2、水样采集及稀释，初发酵实验1）用移液管移取菌液时，单手操作能力还是欠缺，总习惯性的把试管塞放到桌面上在微生物实验过程中，最重要的就是要时刻保持无菌条件，因此一些试管塞应该放到手上而不是桌上在打开每一个试管塞时应该将试管口在火焰上灼烧，操作时尽量距离酒精灯近一些2）移液管依然是用吸耳球吸取液体，由于无菌操作台的玻璃门开启幅度不能过高，以不超过下巴为宜，因此双手在操作台里操作很僵硬，受到限制，移取液体很不方便；多熟悉在无菌操作台条件下进行实验的环境并且要培养自己单手操作的能力，在无菌操作台里尽量避免用吸耳球辅助移液管移取液体，而是训练用口操作。

3）还是准备的不充足，在无菌操作台里需要提前把实验过程中需要用到的一些仪器与试剂等放到里面提前灭菌消毒二十分钟，考虑不全面总会时不时突然想到还有什么东西没拿进来灭菌消毒，于是在这个地方耽误了很长时间因此每次用无菌操作台之前，应该在实验室里将所需物品准备齐全，。