高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术.ppt

高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术高速逆流色谱溶剂体系筛选及其联用技术　　　　　　　　　　　　 晋晓峰晋晓峰 研发部副主管研发部副主管　　　　　　　　　　　上海同田生物技术有限公司　　　　　　　　　　　上海同田生物技术有限公司报告内容报告内容 一、溶剂体系筛选方法一、溶剂体系筛选方法二、高速逆流色谱联用二、高速逆流色谱联用三、三、关于上海同田生物关于上海同田生物一、溶剂体系筛选方法一、溶剂体系筛选方法 HSCCC分离条件分离条件分离分离效果效果溶剂条件转速流速温度样品基本原则基本原则: :Ø 不造成样品分解或变性不造成样品分解或变性Ø 对样品有较大溶解度对样品有较大溶解度Ø 固定相在分离柱中有较好保留固定相在分离柱中有较好保留Ø 样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数样品在两相溶剂系统中有合适的分配系数溶剂体系的筛选方法溶剂体系的筛选方法　1. 分配系数（分配系数（ K ）法）法 K ＝＝ Cs/Cm Cs为溶质在固定相中的质量浓度为溶质在固定相中的质量浓度 Cm为溶质在流动相中的质量浓度为溶质在流动相中的质量浓度 Cs和和Cm的比值可通过的比值可通过HPLC测得测得 理想的分配比值理想的分配比值 k = 0.5~2，允许，允许0.2~5CsCm两种溶质分离因子：两种溶质分离因子： α ＝ K1/K2（>1.5）　当当Cs / Cm ＜＜＜＜0.5时，出峰时间太快，分离度较差时，出峰时间太快，分离度较差当当Cs / Cm ＞＞＞＞2时，出峰时间太长，且峰形变宽时，出峰时间太长，且峰形变宽 芦荟提取物的芦荟提取物的HPLC图谱图谱实例（实例（HPLC法测法测K值）值）芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷A芦荟苷芦荟苷B－ 上层－ 下层体系体系氯仿氯仿/ /异丁醇异丁醇/ /甲醇甲醇/ /水水（（4/0.25/3/2）） 目标物质目标物质芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷A芦荟苷芦荟苷B分配系数分配系数K0.91.92.3HSCCC保留时间保留时间2.3 h4.0 h5.3 h芦荟未知物芦荟未知物芦荟苷芦荟苷A芦荟苷芦荟苷B芦荟提取物的芦荟提取物的HSCCC图谱图谱芦荟苷芦荟苷B芦荟苷芦荟苷A芦荟未知物芦荟未知物Ø对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供对已知化合物类别的物质可参考相关文献，在文献提供的体系的基础上进行调整的体系的基础上进行调整Ø对未知样品对未知样品，，可采用氯仿可采用氯仿-甲醇甲醇-水水=10-3-7或正己烷或正己烷-乙乙酸乙酯酸乙酯-甲醇甲醇-水水=1-1-1-1两个极性分布范围较广的体系两个极性分布范围较广的体系先进行尝试先进行尝试，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂，也可以根据样品的极性选择相对应的溶剂体系，体系，再根据目标组分的分配系数进行调整再根据目标组分的分配系数进行调整　　2. 经验法经验法　　溶剂体系根据极性可以分为三类：溶剂体系根据极性可以分为三类：Ø疏水性（石油醚体系，正已烷体系）疏水性（石油醚体系，正已烷体系） Ø中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系）中等疏水性（氯仿体系，甲基叔丁基醚体系）Ø亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）亲水性（正丁醇体系，乙酸乙酯体系）　　 3. 分析型分析型HSCCC法法 优点：优点：Ø 分析时间短分析时间短Ø 溶剂消耗少溶剂消耗少Ø 进样量小，节省样品进样量小，节省样品Ø 确定的体系可直接用于确定的体系可直接用于 放大制备，重现性佳放大制备，重现性佳仪器：仪器：TBE-20A 转速：转速：1600r/min 流速：流速：0.5ml/min样品：样品：8％％沙棘提取物沙棘提取物体系：正己烷体系：正己烷/ /乙酸乙酯乙酸乙酯/ /乙醇乙醇/ /水水 洗脱方式：下相作为流动相洗脱方式：下相作为流动相实例（分析型实例（分析型HSCCC法）法）1：1：1.2：0.81：1.2：1.2：0.80.8：1.2：1.2：1.20.8：1.2：1.2：1.5正己烷正己烷/ /乙酸乙酯乙酸乙酯/ /乙醇乙醇/ /水水（（0.8：：1.2：：1.2：：1.7））槲皮素槲皮素　　山萘酚山萘酚　　异鼠李素异鼠李素　　HSCCCHSCCC工艺重现性工艺重现性TBE-20A TBE-20A 分析型分析型HSCCCHSCCCTBE-300B TBE-300B 半制备型半制备型HSCCCHSCCCTBE-1000A TBE-1000A 制备型制备型HSCCCHSCCC4.4.多元溶剂体系的选择方法多元溶剂体系的选择方法ØItoIto方法方法ØHBAWHBAW方法方法ØARIZONAARIZONA方法方法 Ito认为溶剂体系的筛选可以从氯仿认为溶剂体系的筛选可以从氯仿- -甲醇甲醇- -水水(2:1:1)(2:1:1)开始，如果开始，如果分配系数落在分配系数落在0.2-5的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数。

的范围内，通过调整可以获得满意的分配系数如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的如果样品主要分布在非水相的下相中时，应尝试下表中箭头向上的体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系体系，如果样品主要分布在上相时，则应试验相反方向的体系ØBHAWBHAW方法是将非极性溶剂体系正已烷方法是将非极性溶剂体系正已烷- -乙腈（乙腈（1:11:1）和极性溶剂体）和极性溶剂体系正丁醇系正丁醇- -水（水（1:11:1）结合起来，形成了）结合起来，形成了7 7种多元溶剂体系，编号为种多元溶剂体系，编号为-3-3～～+3+3Ø首先试验首先试验0 0号溶剂体系，以确定下一步试验的方向如果样品倾向号溶剂体系，以确定下一步试验的方向如果样品倾向于极性的水相，应该进一步实验于极性的水相，应该进一步实验0 0～～+3+3号正方向的体系，否则应该号正方向的体系，否则应该试验试验0 0～～-3-3号反方向的体系号反方向的体系Ø这组溶剂的特点是紫外透明性很好这组溶剂的特点是紫外透明性很好ØARIZONAARIZONA方法是结合乙酸乙酯方法是结合乙酸乙酯- -水体系（水体系（1 1：：1 1，体系，体系A A，极性）和正，极性）和正庚烷庚烷- -甲醇体系（甲醇体系（1 1：：1 1，体系，体系Z Z，非极性）定义了，非极性）定义了2323种整个溶剂范种整个溶剂范围内的溶剂体系，并用围内的溶剂体系，并用A A～～Z Z的的2323个字母（个字母（E E，，I I，，O O除外）表示除外）表示Ø操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系操作时只需做两个实验，将样品分别溶解在体系A A和体系和体系Z Z中，如中，如果绝大部分样品集中在体系果绝大部分样品集中在体系A A的乙酸乙酯相和体系的乙酸乙酯相和体系Z Z的甲醇相，那的甲醇相，那就有可能在体系就有可能在体系A A～～Z Z中找到一个合适的体系中找到一个合适的体系 小结：小结： 溶剂体系的选择是溶剂体系的选择是HSCCC分离中最关键也是难度最分离中最关键也是难度最大的一个环节，一般大的一个环节，一般从样品的溶解度从样品的溶解度，，通过参考文献及通过参考文献及常用体系常用体系, , 测定测定K值等来筛选溶剂体系值等来筛选溶剂体系，然后再通过上，然后再通过上述提到的各种方法进行调整。

述提到的各种方法进行调整 随着逆流色谱技术的普及随着逆流色谱技术的普及，，越来越多的人致力于体越来越多的人致力于体系筛选的研究工作系筛选的研究工作二、高速逆流色谱联用技术二、高速逆流色谱联用技术 TBE-300A+ÄKTAPrimeTBE-300A主机接口主机接口1. HSCCCHSCCC与与ÄKTAÄKTA系列中压系统的联用系列中压系统的联用注意事项：注意事项：ØÄKTA系列设备的出场设置的最高压力为系列设备的出场设置的最高压力为1MPa，适合，适合HSCCC的的0～～2MPa压力范围；如不是，需要设置最高压力范围；如不是，需要设置最高压力为压力为1～～2MPaØÄKTA系列的连接接头为系列的连接接头为M5型号，而型号，而HSCCC为为M6型型号接头，所以连接时需要使用转换接头号接头，所以连接时需要使用转换接头2. HSCCC与与ELSD的联用技术的联用技术优势：优势：Ø基于样品的浓度基于样品的浓度Ø梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰梯度洗脱时基线稳定，无溶剂峰Ø可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物可用于检测挥发性低于溶剂的任何化合物ØHSCCC-ELSD联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，联用技术已成功用于脂肪酸，生物碱，皂苷类，萜类，甾体类等的分离皂苷类，萜类，甾体类等的分离 注意事项：注意事项：ØELSD连接接头为连接接头为M5型号，而型号，而HSCCC为为M6型号，所型号，所以连接时需要使用转换接头以连接时需要使用转换接头( (厂家提供厂家提供) )Ø半制备型和制备型半制备型和制备型HSCCC与与ELSD检测器联用时，需检测器联用时，需用分流器实现同时检测与馏分的收集用分流器实现同时检测与馏分的收集分流器解析图分流器解析图三通管三通管HSCCC组分组分流出口流出口调速阀调速阀组分收集组分收集分流－进入分流－进入ELSD检测器检测器分流－进入分流－进入收集器收集器三通管三通管3. HSCCC-ESI-MS联用技术联用技术Ø高速逆流色谱与热喷雾式质谱联用法是一种新近发展起高速逆流色谱与热喷雾式质谱联用法是一种新近发展起 来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法来的、具有适用范围广和灵敏度高等特点的分析方法Ø可直接用于复杂样品中有关成分的鉴别和测定可直接用于复杂样品中有关成分的鉴别和测定Ø不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离不需要对流出液做任何分离就可用于鉴定，降低了分离过程对样品造成污染的可能性过程对样品造成污染的可能性Ø适用于分析非挥发性或热不稳定性物质适用于分析非挥发性或热不稳定性物质Ø分析速度快分析速度快  HSCCC-ESI-MS ØOka等解决了等解决了HSCCC与质谱联用的根本问题即接口与质谱联用的根本问题即接口问题，设计了问题，设计了T型连接器，发现联用并不影响色谱的型连接器，发现联用并不影响色谱的分离和质谱的分析分离和质谱的分析ØHSCCC-ESI-MS联用技术已成功地用于同时分联用技术已成功地用于同时分离和分析丹参酮离和分析丹参酮ПA，，EGCG，三萜酸，多肽，多酚，三萜酸，多肽，多酚类和黄酮类等类和黄酮类等ØHSCCC能够获得高的溶质能够获得高的溶质- -溶剂比的流出物，从而溶剂比的流出物，从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解Ø高速逆流色谱与傅里叶红外光谱的联用只需要一个高速逆流色谱与傅里叶红外光谱的联用只需要一个简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的简单的流动池接口，不需要其他附加的去除溶剂的方法方法4. HSCCC-FT-IR联用技术联用技术优点：优点：Ø可以在分离的同时获得被分离物的结构信息可以在分离的同时获得被分离物的结构信息缺点：缺点：Ø需要较大的样品量（每种组分需要较大的样品量（每种组分0.2-1mg0.2-1mg））ØRomanach和和De Haseth应用应用HSCCC-FT-IR联联用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚用技术成功地对苯酚、硝基苯酚以及乙酰苯酚等进行了分离与鉴定，记录相应的等进行了分离与鉴定，记录相应的IR光谱光谱小结：小结： 随着随着HSCCCHSCCC的普及，的普及，HSCCCHSCCC与多种其他技术与多种其他技术联用，为联用，为HSCCCHSCCC的应用扩展了更大的空间。

的应用扩展了更大的空间三、关于上海同田生物技术有限公司三、关于上海同田生物技术有限公司  公司位于上海张江科技园，占地约公司位于上海张江科技园，占地约30亩，建筑面亩，建筑面积约积约20000平方米，总投资人民币平方米，总投资人民币6000万元 2008年年11月月25日，上海市高新技术企业认定办公日，上海市高新技术企业认定办公室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市2008年第一批高新技术企业年第一批高新技术企业  公司致力于高速逆流色谱仪（公司致力于高速逆流色谱仪（HSCCC）、）、高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料/ /中间体的研究开发、生产和销售中间体的研究开发、生产和销售  作作为为多多分分离离柱柱高高速速逆逆流流色色谱谱仪仪国国家家新新型型专专利利的的拥拥有有者者、、高高速速逆逆流流色色谱谱领领域域的的领领导导者者，，我我们们与与通通用用电电气气医医疗疗生生物物科科学学中中国国有有限限公公司司（（GE GE Healthcare Healthcare Bio-sciences Bio-sciences co., co., ltd ltd . .）建立了长期的合作伙伴关系。

建立了长期的合作伙伴关系TBE300B＋＋ÄKTA Prime 在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等7 7种种不同产品：不同产品：国内部分代表客户名单：国内部分代表客户名单：香港赛马会中药研究院香港赛马会中药研究院香港大学植物系香港大学植物系中国科学院过程工程研究所（北京）中国科学院过程工程研究所（北京）中国科学院植物研究所（北京）中国科学院植物研究所（北京）国家中药制药工程技术研究中心（上海）国家中药制药工程技术研究中心（上海）山东绿叶天然药物研究开发有限公司山东绿叶天然药物研究开发有限公司 山东聊城大学化工学院山东聊城大学化工学院 泰国泰国德国德国 公司于公司于2008年底已在西班牙，比利时，韩国，泰国，年底已在西班牙，比利时，韩国，泰国，新加坡，瑞士，南非，捷克，意大利，印度等十一个国新加坡，瑞士，南非，捷克，意大利，印度等十一个国家设立了代理商。

家设立了代理商Ø中国对照品行业领导者，中国对照品行业领导者，ISO 9001：：2000质量管理质量管理体系认证企业体系认证企业Ø长达长达10年的对照品研发及标准制定经验年的对照品研发及标准制定经验Ø同田对照品均通过严格的质量检测，附同田对照品均通过严格的质量检测，附HPLC HPLC 检测报检测报告，大部分产品可提供告，大部分产品可提供NMR, MS等图谱银杏内酯银杏内酯 B银杏内酯银杏内酯 A银杏内酯银杏内酯 C 部分对照品获得国家质量监督检部分对照品获得国家质量监督检验检疫总局颁发的标准物质证书验检疫总局颁发的标准物质证书天然植物天然植物< <银杏银杏, ,大豆大豆> >单体提取物单体提取物 上海市高新技术成果转化项目上海市高新技术成果转化项目< <石杉碱甲石杉碱甲> >上海市高新技术成果转化项目上海市高新技术成果转化项目Ø同田对照品质量目前已得到美国，德国，瑞士，英国，同田对照品质量目前已得到美国，德国，瑞士，英国，新加坡等多家标准品经销商及科研院校的认可，公司新加坡等多家标准品经销商及科研院校的认可，公司与国内外多家科研单位保持长期稳固的合作与国内外多家科研单位保持长期稳固的合作Ø同田对照品的品种达到同田对照品的品种达到600多个，并在不断增加多个，并在不断增加地址：上海市张江高科技园区爱迪生路地址：上海市张江高科技园区爱迪生路地址：上海市张江高科技园区爱迪生路地址：上海市张江高科技园区爱迪生路326326326326号号号号邮编邮编邮编邮编：：：：201203201203Tel: 021-51320588 Fax: 021-50320502 Tel: 021-51320588 Fax: 021-50320502 Cell phone: 15921427497Cell phone: 15921427497E-mail: E-mail: tauto@http:// How to Contact Us:。