啤酒发酵酵母扩培学习资料.doc

啤酒发酵酵母扩培学习资料啤酒厂获得接种酵母的方式有三种方式，其优缺点见图2.1：这三种方式是：购买酵母泥；购买纯种酵母；自己保存和培养纯种酵母生产用酵母 购买酵母泥购买纯种酵母自己保存和培养酵母优点：无酵母管理工作无酵母扩培设备缺点：有污染危险花费较高啤酒质量不稳定缺点：需要酵母扩培装置，花费较大优点：方法可行，可靠性高，能得到灭菌的酵母优点：取用灵活，酵母质量可靠，啤酒质量稳定缺点：一次性投资大无菌程度要求高 图2.1 啤酒获得酵母的方式和其优缺点第一节 纯种酵母的培养一、培养啤酒纯种酵母工艺原理酵母是一种兼性微生物，这就是说，细胞的新陈代谢和繁殖即可以在有氧的状态下也可以在无氧的状态下进行啤酒酵母菌的的繁殖过程分为四个阶段（见图2.7）：1．迟缓期：在此期间，虽有营养物质存在，但酵母基本不繁殖；2．对数生长期：此期间酵母繁殖最为迅速；3．稳定期：此时，代谢产物CO2和酒精的积累使酵母繁殖逐渐变慢，活菌数最高；4．衰亡期：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，酵母菌死亡率增加，活菌数减少酵母培养中，最重要的阶段是对数生长期，此时的营养、氧气供给及其他条件如：酵母细胞浓度和温度都必须达到最佳。

酵母由于不断地消耗氧气，必须连续通入足够的无菌空气因为氧气缺乏时，其中一部分酵母会进行发酵，从而产生CO2和酒精，而不是产生新细胞，这样生成的有活力的细胞数就减少了二、啤酒纯种酵母的分离培养啤酒酵母的分离培养就是利用特殊的分离技术，将优良强壮的单细胞酵母从原菌中分离出来，加以扩大培养，供生产使用分离培养的方法很多，工厂常用的是平板分离法或划线分离法获得原菌的方法：（1）从实验室保存的原菌种中分离，原菌种必须先经过几次培养活化的再行分离；（2）从生产中的酵母泥或主发酵液中分离 1．平板分离培养法（又称稀释分离法，见图2.2） 这种方法简单易行，适合于工厂现场使用 先将盛有麦汁的琼脂试管培养基放在热水中融化，冷却至42～45℃，再将准备分离培养的酵母原菌用白金针移植到已融化的培养基内如分离培养发酵液的酵母，则先使之静置，倾出上部清液，留少量发酵液，混合均匀后接种如分离培养酵母泥，需加少量无无菌水或麦汁，稀释后再接种将分离培养的酵母移植于融化的培养基内后，充分振荡，使混合均匀，用白金针从该试管挑少许移植到第2支试管中，随即将第1支试管中的培养基倾注在已灭菌的培养皿中，均匀分布在培养皿底面，使之凝固。

用同样方法再从第2支试管移植到第3支，而后第4支试管内，分别将取样后的培养基倾注在培养皿内，如图所示然后，将培养皿置25～27℃保温箱中培养2～3天，每天检查菌落生长情况，剔除形态上有改变的菌落，选择菌落形态正常、细胞大小均匀的菌落进行培养必要时应进行2～3次重复分离图2.2 平板分离培养法2．划线分离培养法 此法和平板分离法的根据是相似的，各有优点划线法简单，速度较快；平板法在平板上分离的菌落单一均匀，获得纯种的机率略高 用接种针挑取适当稀释的菌液，直接在已灭菌的平面皿培养基上划线（图2.3），在第3或第4划线区可能得到单一菌落然后将所需要的菌落移植到斜面培养基上，以待进一步检查这个方法一般用于分离纯化生产上已有的菌种图2.3 划线分离培养法1,2,3,4-分别表示第1,2,3,4次划线区 3．林德奈氏单细胞分离培养法（小滴培养法，见图2.4） 此法是由汉生氏单细胞分离培养法演变而来的将准备分离培养的酵母或发酵液，移植到已灭菌的麦汁培养基中，经多次稀释至每l滴麦汁仅含1个细胞为止 在无菌室中用白金针取稀释液滴在盖玻片上，或凹形载玻片孔内，可滴3～5排，每排3～5个小点，点要均匀，距离要一致。

将盖玻片翻过来，使有小滴的一面面向凹形载玻片的孔穴，穴内加l滴无菌水，盖玻片和载玻片间用凡士林密封在显微镜下检查每个小滴，将只有1个细胞的小滴位置记下，如图所示将检片置25～27℃培养箱内，培养2～3天，每天检查酵母细胞生长情况 小滴培养每次应做3个以上的检片，经过培养后，加以选择挑选发育正常的菌落，用灭菌的三角形滤纸，把菌落吸出移植到已灭菌的麦汁中，扩大培养，经生理特性鉴定后供生产使用 图2.4 林德奈氏小滴培养法 第二节 啤酒酵母的实验室扩培啤酒酵母纯正与否，对啤酒发酵和啤酒质量的影响很大啤酒生产企业使用的酵母由保存的纯种酵母，经过扩大培养，达到一定数量后，供生产现场使用每个啤酒厂都应保存适合本厂使用的纯种酵母，以保证生产的啤酒具有稳定的风格和特性啤酒酵母扩大培养的顺序如下：斜面试管（原菌种）→ 富氏瓶或试管培养 → 巴氏瓶或三角瓶培养 → 卡氏罐培养→ 汉生罐培养 → 酵母扩大培养罐 → 酵母繁殖罐 → 发酵罐以上从斜面试管到卡氏罐培养为实验室扩大培养阶段；汉生罐以后为生产现场扩大培养阶段实验室扩大培养酵母的顺序：1．斜面试管一般是啤酒工厂保藏的纯粹原菌或由科学研究机构和菌种保藏单位供给。

2．富氏瓶培养富氏瓶内盛麦汁10ml，灭菌后备用将种酵母用白金针或巴氏滴管接种于富氏瓶内，在25～27℃保温箱中培养2～3天，每天定时摇动，使沉淀的酵母重新分布到培养基中同一种酵母每次培养2～4瓶，扩大时加以选择3．巴氏瓶培养取500～1000ml的巴氏瓶，加入250～500ml麦汁，加热煮沸，使瓶内蒸汽从侧管喷出，30分钟后，吸出弯曲管内的凝结水，塞上棉花塞，冷却备用在无菌室内，将试管中的酵母液由侧管接种入巴氏瓶内中，在25℃保温箱中培养2天，每天检查培养情况为了使啤酒酵母能逐渐适应低温环境，可将培养温度适当调节到20℃左右，但培养时间要略长一些巴氏瓶也可用大三角瓶或平底烧瓶代替4．卡氏培养罐实验室酵母扩培一般是利用装5ml麦汁的容器，将酵母菌接种于此容器中酵母繁殖分几次进行，把处于高泡阶段的培养液倒入大约10倍的容器中为保证酵母良好快速的生长繁殖，一般扩培倍数不超过10倍实验室酵母扩培通常截止到不锈钢卡氏罐，这是与生产现场扩培的连接环节通常所用容器体积及麦汁接种量见表2.1卡氏罐的容量：小卡氏罐8～10L，大卡氏罐20～25L表2.1 扩培容器容积与接种麦汁量容器代号12 3容器体积/ml无菌麦汁量/ml接种量/ml总量/ml105-51005055510005005555512345（1）卡氏罐的外形结构（见图2.5）图2.5 卡氏罐1－空气过滤器 2－紧箍把 3－绝缘手柄 4－取样阀 5－带橡皮膜的接种头（2）卡氏罐培养酵母的操作工艺流程（见图2.6）卡氏罐有3个紧箍使其密封，卡氏罐一般都带有绝缘手柄、无菌空气过滤器和取样阀。

在卡氏罐内注入麦汁，其量约为总容量的50～80%，将卡氏罐和麦汁一起加热煮沸灭菌，然后放置于冰箱或冷房间内冷却至接种温度备用在加热灭菌时，先拔去侧管的棉塞，使蒸汽从侧管和弯曲管喷出30min，停止加热，然后塞上棉塞，吸去弯曲管内的冷凝水麦汁中增添1L无菌水，以补充水分的蒸发大多数卡氏罐都有带橡皮膜的接种头，在无菌条件下通过接头使用注射器接种接入酵母时，接种量为100～200ml通过取样阀上的无菌空气接头，使无菌空气通过垂直升液管从底部进入麦汁以促进酵母繁殖若已达到期望的酵母细胞数，则将经过空气过滤机的压缩空气压入，酵母菌液从垂直液管和取样阀被压出，送入汉生罐使用后，卡氏罐必须拆开用清洗剂进行人工清洗，并于使用前检查过滤器是否清洁和完好卡氏罐一般接入1～2个巴氏瓶的酵母液，摇动混合均匀后，置于15～20℃下保温3～5天，即可进行扩大培养，或可供约100L麦汁发酵用一般情况下，卡氏罐的最大工作压力为0.2MPa3）卡氏罐的优点麦汁杀菌可使用杀菌锅，也可使用燃气炉或电热炉代替；适于麦汁通氧；给酵母转移提供了安全的条件；较易清洗；运输方便麦汁量大时，不能在实验室进行酵母扩培，因为送输很困难因此，需要在车间的酵母扩培设备中继续进行扩大培养。

加热 蒸汽出 通入无菌空气 接种 通入无菌空气 送往下一级扩培 图 2.6 卡氏罐酵母培养流程 口5．实验室扩大培养的技术要求（1）一切培养用具必须彻底刷洗干净，塞好棉塞，干热灭菌，灭菌温度170℃左右；（2）培养用的培养基，应使用现场加酒花的麦汁，加热煮沸并加蛋白澄清，利用蒸汽间歇灭菌后，在25℃保温箱中贮存2～3天，证明无污染后，方可使用；（3）每次扩大稀释倍数约10倍以下；（4）每次移植接种后，要镜检酵母细胞的发育情况；（5）随着每阶段的扩大培养，培养温度逐步降低，以适应现场发酵情况；（6）每个扩大培养阶段，均应做平行培养：试管4～5只，巴氏瓶2～3个，卡氏罐2个，选择优者进行扩大培养第三节 啤酒酵母的车间扩培卡氏罐培养后，酵母进入现场扩大培养酵母扩大繁殖的方法可根据工厂具体条件进行啤酒厂一般都有汉生（Hansen）罐培养设备，可连续使用1株酵母，反复多次扩培而不需换种，直至酵母出现衰退和染菌等异常情况酵母生理状态与扩培工艺之间的关系见图2.7图2.7 酵母生理状态与扩培工艺之间的关系同化法 传统酵母扩培 时间 细胞数 迟缓期 对数生长期 稳定期衰亡期 一、开放式酵母扩培生产规模较小的啤酒厂一般不配置专用的酵母纯种扩培设备，有的往往直接从大啤酒厂购买酵母泥。

以这种方式进行生产，虽然启动生产很方便，但由于容器卫生和运输问题，实际上很难保证酵母的卫生和质量在这种情况下，啤酒厂可自行实施酵母的简易扩培1．传统的开放式酵母扩培方法（见图2.8）其工作方式与实验室的扩培大致相同从试管到小三角瓶，再从小三角瓶到4×5L的大三角瓶，酵母数量逐步扩大最后用带盖的、容量约200L的金属容器进行扩培，然后进入生产，在较小的发酵池中继续增殖和发酵，其参数见表2.2表2.2 发酵池体积与接种酵母液量 发酵池体积L煮沸终了麦汁量接种的嫩啤酒（菌种）量总容积22507503000图 2.8 传统开放式酵母扩培采用这种方式进行扩培，人们很方便地就可以将酵母培养液扩大化至5吨从试管到三角瓶的酵母培养要使用无菌麦汁，之后的培养过程则全部使用生产麦汁2．小罐式酵母扩培方法这种扩培方法是，酵母在一个容量为40L、且容易清洗的金属罐中增殖培养根据生产规模，也可以使用多个罐但其中一个必须作为原种罐，用于下一次扩培此种方法简单、方便，是一种很实用的酵母扩培方法工作方式如下（见图2.9）：图2.9 罐式酵母扩培1－40L罐中接种25L嫩啤酒 2－纯种培养池将一个罐彻底清洗干净，用蒸汽灭菌，然后接入20L经高温灭菌的无酒花麦汁，在大约20℃的温度下，酵母很快增殖，并形成丰富的泡沫。