蝴蝶兰类原球茎农杆菌介导的转基因体系构建.doc

蝴蝶兰类原球茎农杆菌介导的转基因体系构建蝴蝶兰 (Phalaenopsis aphrodite) 为兰科蝴蝶兰属植物 , 其花色艳丽而丰富、形似蝴蝶而优美 , 且花期长 3~4 个月之久 , 极具观赏价值和经济价值 , 在国内外市场广受大众喜爱本试验前期以蝴蝶兰组培苗叶片为诱导材料 , 构建了一个较为稳定的类原球茎诱导体系 , 为蝴蝶兰转基因试验提供了受体材料后期以蝴蝶兰类原球茎和组培苗叶片为受体材料 , 研究了侵染液浓度 , 侵染时间 , 侵染添加物质等多种因素对蝴蝶兰遗传转化的影响 , 探索最佳遗传转化条件并采用农杆菌介导法成功地将目的基因转入了蝴蝶兰受体材料 , 构建了蝴蝶兰类原球茎转基因体系 , 为后续导入目的外源基因及基因功能验证等工作奠定基础主要研究结果如下 :(1) 蝴蝶兰类原球茎诱导体系的建立最适叶片的选择 : 生长 4~5 周 , 大小为 8~12mm× 10~13mm(叶宽×叶长 ) 的蝴蝶兰叶片是诱导 PLB的较好选择叶基部的 PLB诱导率、 PLB数目、芽诱导率均最高 , 叶尖部和叶中部次之 ; 故叶基部是诱导 PLB的较好选择按不同规格切割的叶片当中 , 规格为 10mm×3mm的叶片最多长出 PLB,PLB诱导率达 52.78%;其次是 10mm×5mm的叶片 ,PLB 诱导率达 22.22%。

蝴蝶兰叶片诱导类原球茎最适培养基为 :1/2MS+TDZ 0.2mg/L+BA 4mg/L+CW20%+PVP3g/L+sucrose15g/L,Phytagel 3g/L,pH 为 5.5, 其 PLB诱导率达 47.21%,每个叶片上诱导出 PLB数目平均值为 8.15 个结果表明使用 0~1mg/L 的 TDZ和 0~4mg/L 的 BA对叶片诱导 PLB都具有积极作用 (2) 类原球茎的增殖与分化最适的类原球茎增殖培养基为 :1/2MS+ZT3mg/L+adenine sulfate 10mg/L+CW15%+peptone2g/L+sucrose15g/L+AC1g/L,Phytagel 3g/L,pH为 5.5最适的类原球茎分化培养基为 : 花宝 +BA 3mg/L+CW15%+sucrose15g/L+PVP2g/L,Phytagel 3g/L,pH 为 5.5 3) 农杆菌介导的转基因体系的构建以蝴蝶兰类原球茎为受体材料 , 采用植物表达载体为pCAMBIA1301(含 gus 报告基因和潮霉素抗性基因 hpt), 菌株为 EHA105的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 通过农杆菌介导法成功构建蝴蝶兰类原球茎转基因体系。

蝴蝶兰类原球茎预培养 2~3d, 农杆菌菌液 OD为 0.3, 侵染时间为 60min, 共培养时间 44~52h 的转化条件下 , 在含有 10mg/L 潮霉素、 300mg/L 羧苄青霉素的筛选培养基中选择培养 55d 后经 GUS、PCR检测 , 转化效率最佳 , 其抗性 PLBs成活率达到 40.82%,GUS检测阳性表达率达到 9.91%,PCR检测阳性表达率达到 19.24%。