烟草瞬时转化.docx

本氏烟草（N. benthamiaA瞬时表达及相关实验方法:一、 农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、 实验步骤：1、 根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌2、 将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28°C, 200rpm过夜估算时间，防止农杆菌液浓度超过10D,否则会影响转化效率3、 当菌液0D值介于〜之间时，1000g, 5min离心收集农杆菌4、 用 2ml Induction medium（without AS） 轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液5、 重复步骤 46、 所得沉淀用 1ml Induction medium 重悬7、 室温放置1〜4 小时8、 测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）9、 用不加针头的注射器将侵染液注射进6〜8 周大的本氏烟草叶片中使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH10nMMgCl2AS推荐提前配制母液10mM200uM1M MES-KOH过滤灭菌，4C保存，用时稀释100倍。

1M MgCl2AS 溶于 DMSO过滤灭菌，4C保存，用时稀释100倍有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融）， -20C用高压灭菌的超纯水稀释C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24 小时之后到一周之内 都会有表达严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48 小时至72小时 不同蛋白表达量都比较可观，不要错过D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在〜之间过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。