HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.doc

HE 染色1. 取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以 6mm 6mrK 5mm 为宜注意事项：(1 取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变 化2切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分2. 固定将切好的组织用生理盐水组织洗 3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或 4% 多聚甲醛中固定，固定 36小时注意事项：(1 一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免 引 起化学变化 ， 失去固定作用2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如 果混合太早，固定时就没有作用了3固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的 20~30倍，有些水分多的材料 中间应更换 1-2次新液4材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并 随 同材料在溶液中投入相应的标签 ， 以免相互混淆标签上注明固定液、材料来源、 日期等标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写脱钙72小时中间不换液是样本 30倍中杉金桥(进口脱钙液镊子触质粒由硬变韧性为准美:固定 3-5 天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。

3. 洗涤材料经固定后，PBS或双蒸水冲洗约3小时20,30,30,60(美:流水冲洗约 4 小时4. 脱水材料依次经 80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水， 各 30min 注意事项：(1 脱水必须在有盖的玻璃品中进行， 防止吸收空气中的水分2在更换高一级的脱水剂时， 最好不要移动材料以免损坏， 可用吸管吸出器皿中的脱水剂， 再用吸水吸尽器皿内剩余液， 然后于皿中加入高一级脱水剂3在低浓度酒精中， 每级停留不宜太长， 否则易使组织变软， 助长材料的解体4 在高浓度或纯酒精中， 每级停留的时间也不宜太长， 否则会使组织变脆， 影响 切 片5如需过夜， 应停留在 80%酒精中6 脱水必须彻底， 否则不易透明， 甚至使透明剂内出现白色混浊现象(美：80%的酒精X2小时95%的酒精X2小时 100%的酒精〉2小时〉2100%的酒精X1小时或者更长时间5. 透明（环保透明脱蜡液中杉金桥纯酒精'二甲苯等量混合液15min,二甲苯I 60min、U 30min （至透明为止由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要 经过二甲苯以过渡当组织中全部被二甲苯占有时 ，光线可以透过,组织呈现出不同 程 度的透明状态。

透明注意事项（1 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入2 更换每级透明剂,动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免 吸 收湿气3 在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退 回 纯酒精中重新脱水，然后再透明美:二甲苯2小时二甲苯2小时二甲苯2小时6 透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液60min,再放入石蜡I 60分钟、石蜡U透蜡30分 钟透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等，使石蜡渗透到组织内部达到饱 和程度以便包埋透蜡时间根据组织大小而定透蜡应在恒温箱内进行 ，并保持箱 内 温度在55-60C左右，注意温度不要过高，以免组织发脆一般置于恒温箱0.5h透蜡注意事项(1 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；(2 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；(3 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变 脆、收缩等美:石蜡 2小时石蜡 2小时石蜡 2小时7. 包埋包埋时，用镊子夹取石蜡模子(金属质地在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从 温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡再将镊子稍加热，夹取材料将切面朝 下放入蜡模中，排列整齐。

再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡8. 切片① 将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上② 将切片刀固定在刀夹上 ， 刀口向上③ 摇动推动螺旋 ， 使石蜡块与刀口贴近 ， 但不可超过刀口④ 调整石蜡块与刀口之间的角度与位置 ， 刀片与石蜡切片约成 15 度左右⑤ 调整厚度调节器到所需的切片厚度 ， 一般为 4-10 微米⑥ 一切调整好后主可以开始切片此时右手摇动转轮 ，让蜡块切成蜡带 ，左手毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以 40-50r/min⑦ 切成的蜡带到 20-30cm 长时, 右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲， 并 牵引成带 ， 平放在蜡带盒上 ， 靠刀面的一面较光滑 ， 朝下 ， 较皱的一面朝上⑧ 用单面刀片切取蜡片一小段 ， 放在载玻上加水一滴 ， 置于放大镜或显微镜下观 察切片是否良好⑨ 切片工作结束后 ， 应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡 ， 把切片机擦拭 干净妥为保存9. 展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40-45C,另准备30%乙醇溶液② 切片时,将一碗 30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上② 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带， 放在乙醇溶液的水面上， 使切片展开。

可省③ 小镊子轻轻地将连在一起的切片分开， 用一个载玻片将切片完整， 已展开的切 片捞至温水中， 使之充分展开④ 另取洁净的载玻片， 捞起展开的切片,使其位于切片1/3处,另一端（磨边,粗糙 的一端磨面上标记或贴上标签， 放于切片架上10. 脱蜡复水将温箱温度调至65C,待温度控制在60C时,将切片连同切片架放入干燥的温箱内 3-5 小时至蜡熔化之后,石蜡切片经脱蜡透明I、U脱蜡各20mi n,勿动（防治组织掉此步为关键步请 轻拿轻放然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各5min,再 放入 蒸馏水中 3min11. 染色 切片放入苏木精中染色约10-30mi n染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长室温高时促 进 染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色12. 水洗用自来水流水冲洗约15min使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可，但要注意 流水不能过大， 以防切片脱落13. 分化将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色， 约2秒至数十秒钟见切片变红， 颜色较浅 即可14. 漂洗（反蓝切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色15. 脱水 I切片入50%乙醇一70%乙醇一80%乙醇中各5min。

没放5016. 复染用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min伊红主要染细胞质， 着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合， 如果细胞核染 色较浓， 细胞质也应浓染， 以获得鲜明的对比反之， 如果细胞核染色较浅， 细胞质 也应 淡染可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染， 促使细胞质容易着色， 并且经乙 醇脱水时不易褪色17脱水U将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色撚后放入无水乙醇中3-5min最后用吸水纸吸干多余的乙醇18 透明切片放入二甲苯 I、U 中各 5min二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收 水分切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则 切片难以镜检19.封藏:中性树胶圭寸存因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为圭寸藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适 的 稠度封藏的方法：封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片材料透明后，在桌上放一张 洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上，迅速地 在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行，用右手持小镊子轻轻地 夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这 样就可以减少或避免产生气泡。

如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边 缘 补足如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色免疫组化染色1.石蜡切片，步骤同前切片经贴片后，60C烤片30min使蜡熔化，经二甲苯I、U各I0min,脱蜡然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min,再放入蒸馏水中3min,水化2. 脱蜡和水化后，用PBS （pH7.4具体看所用抗体及染色试剂说明冲洗3次，每 次 3 分钟洗瓶冲洗3. 根据抗体的要求， 对组织抗原进行相应的修复可选步骤， 具体见抗体说明 书4. 每张切片加1滴或50卩丨3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过 氧化物酶的活性PBS冲洗3次，每次3分钟此步骤是对内源性过氧化物酶含量高 的组织而言4•除去PBS液，每张切片加1滴或50卩的第一抗体，室温下孵育60分钟或4C 过夜，具体参见每种抗体的说明书PBS冲洗3次，每次3分钟5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50卩即用型MaxVisionTM试剂或SP试剂， 室温下孵育10-15分钟PBS冲洗3次，每次3分钟。

6•除去PBS液，每张切片加2滴或100卩新鲜配制的DAB或AEC溶液,显微镜 下观察3-5分钟（DAB或37 T环境下10-30分钟（AEC7.自来水冲洗，苏木素复染10分钟,PBS或自来水冲洗返蓝如果用DAB显色， 则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用 AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。