基于纤维蛋白原活性的红花注射液抗凝血谱-效关系研究.docx

基于纤维蛋白原活性的红花注射液抗凝血谱-效关系研究 徐玉玲　贺桢翔　刘钱　曾奇璐　曹鑫　吕海洋　刘涛摘要：通过生物活性检测结合化学指纹图谱分析，探索红花注射液抗凝血活性成分以红花注射液为研究对象，测定7批红花注射液的指纹图谱和抗凝血活性值，再基于StatisticalProductandServiceSolutions软件，运用主成分分析-相关性分析-多重线性回归的分析方法对抗凝血活性值和色谱指纹图谱数据建立谱-效回归评价模型，另取6批红花注射液对模型进行验证纳入模型的6个自变量对抗凝血活性能力的影响均具有统计学意义（P<0.05），预测值和实测值的相对误差均在10%以内建立的谱-效回归模型可较好地通过红花注射液图谱数据评价其抗凝血生物活性关键词：红花注射液;指纹图谱;抗凝血活性;回归模型;谱-效关系：R284文献标志码：A：1674–5124（2019）02–0059–050 引言红花注射液由红花（Carthamus tinctoriusL.）经水煮醇沉工艺加工而成，具有活血化瘀之功效，临床用于闭塞性脑血管等疾病的治疗[1]红花注射液现行标准及相关质量研究文献主要集中于对其个别化学成分，如羟基红花黄色素A的定量测定与特征图谱研究等方面[2]。

由于中药注射液成分复杂，临床使用时安全风险较大，控制个别成分含量无法控制药品的安全性、有效性和稳定性[3]在一定波长下建立的指纹图谱可在一定程度上反应药品质量均一性及稳定性[4]但是，中药指纹图谱仅控制了检视波长下可测定的成分，却并不能标示哪些成分与药物的药效相关，也并不能体现其相关程度;因此，只利用指纹图谱来评价中药质量还有较大局限性[5]只有根据药物的基本属性，以药效为基准，并定量或定性控制与临床疗效相关的化学成分建立的药物质量标准，才能更好地评价中药质量，而中药谱-效相关性研究可以达到这一目的谱-效关系研究由3个阶段组成，一是建立指纹图谱，二是建立药效学方法，三是采用合适的数据处理方法将指纹峰与药效数据进行关联分析，从而建立谱-效模型本研究通过建立红花注射液的HPLC指纹图谱，并采用纤维蛋白原平板法，以抗凝血效应强度为指标，对红花注射液抗凝血作用强度进行测定[6]，运用“主成分分析-相关性分析-多重线性回归”的分析方法，对红花注射液抗凝血活性值和色谱指纹图谱数据建立谱-效回归评价模型，可以实现对药效作用的预测和评价同时也可阐明指纹图谱特征与药效的相互关系，确定相应的药效物质基础，更有针对性地控制中药质量。

1 材料iChrom P5100型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）;HS-3120超声波清洗器;JJ-CJ-2FD洁净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）;DH系列电热恒温培养箱（西安禾普生物科技有限公司）;XFS-280手提式壓力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）凝血酶试剂（上海经科化学科技有限公司，批号T20180401）;牛血纤维蛋白原试剂（上海经科化学科技有限公司，批号F20180401）;氯化钠注射液（四川科伦药业股份有限公司，批号N17122008-1）;紫丁香苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号180218）13批红花注射液：公司A，批号170502、170701、170702、171001、171002、180101、180102、180401、180402、180403、180404;公司B，批号170314;公司C，批号1703012 方法与结果2.1 红花注射液抗凝血活性值的测定2.1.1 供试品溶液的制备将红花注射液与32U/mL凝血酶按1∶1混合，混合反应30min后即供试品溶液2.1.2 纤维蛋白原平板的制备取经高压蒸汽灭菌后的直径为10cm的平皿，分别依次加入加热至85C的1%琼脂溶液20mL，0.3%的纤维蛋白原溶液15mL，轻轻摇匀，冷却静置30min，分别打出直径为3.5mm的孔，备用[7]。

2.1.3 对照品溶液及阴性样品的制备精密称取活性为10000U的凝血酶粉末适量，用生理盐水配制浓度为40U/mL的溶液，备用阴性样品为纯净水2.1.4 标准曲线的绘制根据预实验结果，取纤维蛋白平板，分别精密吸取25μL质量浓度2，4，6，8，10U/mL的凝血酶溶液点样，置于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定沉淀圈，以凝血酶浓度（U/mL）为横坐标（X），沉淀圈面积（mm2）为纵坐标（Y），得线性方程为Y=7.3386X+31.939，r2=0.9991结果表明，凝血酶在2～10U/mL与沉淀圈面积呈良好的线性关系取纤维蛋白平板，分别精密吸取25μL质量浓度8，16，24，32，40U/mL的凝血酶点样，置于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定沉淀圈，以凝血酶浓度（U/mL）为横坐标（X），沉淀圈面积（mm2）为纵坐标（Y），得线性方程为Y=5.6685X+65.82，r2=0.994结果表明，凝血酶在8～40U/mL与沉淀圈面积呈良好的线性关系2.1.5 精密度试验1）同板精密度试验：取红花注射液（批号：170701）1mL，按2.1.1方法制备供试品溶液，精密吸取25μL，取纤维蛋白原平板，同板点样，共点6次，同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，置于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值，计算其RSD值为4.44%，结果表明同板精密度良好。

2）异板精密度试验：取红花注射液（批号：170701）1mL，按2.1.1项方法制备供试品溶液，精密吸取25μL，取纤维蛋白原平板，异板点样，共点6次，同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，置于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值，计算其RSD值为2.88%，结果表明异板精密度良好2.1.6 重复性试验取红花注射液（批号：170701）各1mL，按2.1.1项方法分别平行制备6份供试品溶液，精密吸取25μL，取纤维蛋白原平板，同板点样，同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值，计算RSD值为2.09%，结果表明重复性良好2.1.7 稳定性试验取红花注射液（批号：170701）各1mL，按2.1.1项方法制备6份供试品溶液，精密吸取25μL，取6个纤维蛋白原平板，凝血酶与供试品混合30min后于0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h后分别点样，并同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值，计算其RSD值为4.48%，结果表明样品在3h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验精密吸取红花注射液（批号170502，抗凝血活性值为10.71U/mL）6份，每份与32U/mL凝血酶按1∶1混合30min后，再与20U/mL凝血酶按1∶1混合30min，取纤维蛋白原平板，同板点样，同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值，计算加样回收率为105.26%，RSD值为1.20%2.1.9 样品活性测定按2.1.1项方法制备7份供试品溶液（批号170502、170701、170702、171001、171002、180101、108102），取纤维蛋白原平板，同板点样，同时点样2，8，40U/mL的凝血酶、生理盐水、纯净水各25μL，置于恒温培养箱中（37C）培养16h，测定抗凝血活性值测定结果如图1、表1所示2.2 红花注射液化学成分群数据库的建立2.2.1 红花注射液供试品溶液的制备精密移取红花注射液5.0mL置于10mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，既得供试品溶液2.2.2 色谱条件色谱柱为SupersilODS2色谱柱（4.6mm250mm，5μm），流动相为甲醇（A）-10mL/L冰醋酸溶液（B），梯度洗脱（0～90min，0%～70%A）;体积流量1.0mL/min，进样体积10μL;检验波长270nm;柱温30C。

2.2.3 稳定性试验取红花注射液（批号170701）按2.2.1项方法制备供试品溶液，将同一供试品溶液分别于0，3，6，9，12，15，18，21，24h进样分析，计算各共有峰相對峰面积和相对保留时间，其RSD值分别小于2.00%和1.00%，以0h的图谱数据作为参照，相似度RSD值小于1%，结果表明供试品在24h内稳定2.2.4 精密度试验取红花注射液（批号170701）按2.2.1项方法制备供试品溶液，同一供试品溶液重复进样5次，计算各共有峰相对峰面积和相对保留时间，其RSD值分别小于2.00%和1.00%，以第1次进样的图谱数据作为参照，相似度RSD值小于1%，结果表明仪器精密度良好2.2.5 重复性试验取红花注射液（批号170701）按2.2.1项方法平行制备供试品溶液5份，进样分析，计算各共有峰相对峰面积及相对保留时间，其RSD值分别小于2.00%和1.00%，以第1份供试品的图谱数据作为参考，相似度RSD值小于1%，结果表明该方法重复性良好2.2.6 化学成分群图谱的构建取7批红花注射液，分别按照2.2.1项方法平行制备供试品溶液，按2.2.2项色谱方法测定通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”对数据进行分析[8]，生成红花注射液指纹图谱的共有模式，确定了8个共有峰，如图2所示。

7批红花注射液指纹图谱见图3其中6号峰为紫丁香苷对照品，其液相色谱图见图42.3“红花注射液谱-效相关性分析2.3.1 最优主成分数的确定采用“Statistical Product and Service Solutions”（SPSS）中“Reduction”的“Factor”考察最优主成分数，最优主成分确定根据解释数据变异的比例、前几位主成分解释数据变异的总比例和陡坡图检验[9]结果见表2和图5由图、表可知，当主成分数为6时，前6位主成分解释数据变异的总比例为100%，且陡坡图在第6主成分之后趋于平缓;因此，该分析模型的最优主成分数为62.3.2 主成分的确定运用SPSS中“Correlate Bivariates”的“Pearson”分析各共有峰和抗凝血活性强弱的关系[10]，根据两连续变量间相关的强弱确定主成分为峰2、3、4、6、7、8各共有峰和抗凝血活性相关性强弱结果见表32.3.3 谱-效相关数学模型的构建运用SPSS中“Regression”的“Linear”，以峰面积为X，抗凝血活性为Y，采用多重线性回归，建立谱-效相关性评价模型，计算各共有峰的标准化回归系数，结果见表4。

回归方程可以表示为：Y=9.696158+0.006147峰2?0.009241峰3?0.016023峰4+0.005000峰6+0.006512峰7?0.001052峰8纳入模型的6个自变量对抗凝血活性能力的影响均具有统计学意义（P<0.05）2.4 红花注射液谱-效评价模型的验证另取6批红花注射液，测定其抗凝血活性值，对已建立的谱-效评价模型的准确性和适用性进行验证，结果见表5结果显示6批验证红花注射液抗凝血活性的模型预测值与实际测量值的相对误差在10%之内，结果表明建立的模型对红花注射液抗凝血活性值具有较好的评价效果3 结束语红花注射液目前执行标准为WS3-B-3825-98-2012，其标准中仅对羟基红花黄色素A和总黄酮进行了定量测定但是，中药的疗效并不是单一成分或几个成分的药效体现，而是众多成分的协同药效作用体现，因此，对单一成分或大类成分的质量控制，并不能控制中药的内在真实。