Toll样受体4 siRNA 表达载体的构建及其在体外对RAW264.7细胞TLR4的抑制效果临床医学论文.doc

Toll样受体4 siRNA 表达载体的构建及其在体外对RAW264.7细胞TLR4的抑制效果_临床医学论文 作者：徐哲，黄长形，李羽，王平忠，任广立，张岩，刘清泉，贾战生，聂青和，孙永涛，白雪帆 【摘要】 　　目的： 构建针对小鼠Toll样受体4(TLR4)的小干扰RNA(siRNA)表达载体，体外评价对RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白水平的抑制效果；观察对TNFα， MIP2水平及p38MAPK， ERK1/2磷酸化水平的影响. 方法： 根据siRNA设计原则并经BLAST比对，设计合成7条siRNA双链复合体，体外退火后在T4连接酶作用下连接入重组载体pSilencerTM 4.1CMV neo plasmid，连接产物转化JM l09感受态细胞，筛选阳性克隆并提取重组体，行HindⅢ及BamHⅠ双酶切，酶切产物经聚丙稀酰胺凝胶电泳确定插入片段，测序鉴定；RTPCR检测TLR4 mRNA水平变化，间接免疫荧光及Western Blot检测TLR4蛋白水平变化；用LPS刺激转染细胞，观察TNFα及MIP2水平的变化，Western Blot检测p38MAPK及ERK1/2磷酸化水平的变化. 结果： 双酶切及测序证实重组载体构建成功；体外实验表明，RAW264.7细胞中TLR4 mRNA及蛋白水平均降低；TLR4 siRNA抑制LPS对TNFα及MIP2表达的上调作用，LPS对p38MAPK及ERK1/2的活化作用亦被TLR4 siRNA下调. 结论： TLR4 siRNA表达载体在体外可下调RAW264.7细胞的TLR4表达，抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，对LPS诱导的RAW264.7细胞TNFα及MIP2的分泌有抑制作用，TLR4 siRNA可望作为调控LPS信号通路的一个有效工具. 【关键词】 Toll样受体4；RNA，小分子干扰；脂多糖类；巨噬细胞　 【Abstract】 AIM: To construct siRNA expression vectors targeting the gene of mouse Tolllike receptor 4(TLR4), to evaluate the inhibition effects of TLR4 siRNA on the mRNA expression and protein level of TLR4 in RAW264.7 cells in vitro and to observe the changes of TNFα and MIP2 levels and the phosphorylation levels of p38MAPK and ERK 1/2. METHODS: According to the siRNA design principles and screening by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), we designed and synthesized 7 pairs of siRNA duplex targeting TLR4. The siRNA duplex were ligated into the recombinant vector pSilencerTM 4.1CMV neo plasmid, then the ligation products were transformed into competent cells of E.coli JM109 and then recombinant colonies were selected. The positive colonies were picked for double restriction enzyme digestion with HindⅢ and BamHⅠ and sequencing, and the restriction digest products were separated by SDSPAGE to confirm the insert size. We determined the changes of TLR4 mRNA levels by RTPCR and evaluated the protein levels of TLR4 by indirect immunofluorescence assay and Western Blot. Furthermore, we stimulated the transfected cells with LPS and examined the changes of TNFα and MIP2, and detected the phosphorylation levels of p38MAPK and ERK 1/2 by Western Blot. RESULTS: The recombinant vectors were successfully constructed as confirmed by enzyme digestion and sequencing. The in vitro experiment indicated that TLR4 siRNA markedly downregulated the TLR4 mRNA and protein levels in RAW264.7 cells. Treatment with TLR4 siRNA significantly decreased the rising amplitude of TNFα and MIP2 caused by LPS. TLR4 siRNA treatment also downregulated the phosphorylation levels of p38MAPK and ERK 1/2 activiated by LPS. CONCLUSION: TLR4 siRNA expression vectors markedly downregulate TLR4 expression and inhibit the MAPK signaling pathway in RAW264.7 cells in vitro, and significantly reduce the production of TNFα and MIP2 evoked by LPS. TLR4 siRNA may be a potential tool in the modulation of the LPS signaling pathway.【Keywords】 TollLike Receptor 4; RNA, small interfering; Lipopolysaccharides; Macrophages　　 0引言由肠源性内毒素血症诱发的、以TNFα为核心的细胞因子 网络 所致的介质病（mediator disease），在肝功能衰竭的发病机制中起到非常重要的作用. Toll样受体4(tolllike receptor 4, TLR4)是近年来发现的对LPS应答的主要受体，TLR4表达量或位置的异常与急性肝功能衰竭等疾病的发病有关［1-4］. TLR4是巨噬细胞中LPS信号转导的限速因子，通过改变TLR4的结构和表达或可调控LPS信号通路. 本实验我们构建了针对小鼠TLR4的小干扰RNA(siRNA)表达载体，进行酶切及测序鉴定，体外评估其对TLR4 mRNA、蛋白表达水平的抑制作用，旨在评价TLR4 siRNA对TNFα， MIP2水平的影响及对LPS诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的作用.1材料和方法 1.1材料siRNA表达质粒pSilencerTM 4.1CMV neo购自美国Ambion公司，为氨苄抗性新霉素筛选线性载体，两端酶切位点为HindⅢ， BamHⅠ. 7条siRNA双链复合体均由上海Invitrogen公司合成. 阴性对照siRNA (pNC)由美国Ambion公司提供，其所携带的siRNA序列与小鼠、人、大鼠基因组均无同源性.采用本室保存JM l09菌制备感受态细胞，TLR4引物，上游： 5′TTTATTCAGAGCCGTTGG3′, 下游：5′GGCTATCTGTGAGCGTGT3′; TNFα引物，上游：5′ATGAGCACAGAAAGCATGATC3′, 下游：5′TACAGGCTTGTCACTCGAATT3′; MIP2引物，上游：5′GAACAAAGGCAAGGCTAACTGA3′, 下游：5′AACATAACAACATCTGGGCAAT3′; GAPDH引物, 上游：5′AACGACCCCTTCATTGAC3′, 下游： 5′TCCACGACATACTCAGCAC3′，各引物由上海Invitrogen公司合成.鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞（上海午立公司）；siPortXP1（美国Ambion公司）.1.2方法1.2.1siRNA靶向序列设计将基因库收录的小鼠TLR4基因全序列(NM_021297)作为靶向分子，采用美国Ambion公司设计工具，根据siRNA的一般设计原则及研究者经验，选择起始密码子100 nt后，G/C含量在30%~52%，基本无内部重复序列，设计合成了7条21 nt的特异性siRNA双链复合体，两端酶切位点分别为HindⅢ和BamHⅠ，并与基因库小鼠来源的基因序列进行BLAST比对，选择同源性小的7对序列送公司合成.根据评分原则［5］评分，此7对siRNA得分均在6分以上，相应合成的DNA各链均含酶切位点和颈环，每条单链为55 bp.1.2.2载体构建常规氯化钙法制备JM 109感受态Ecoli，将合成的55 bp正、负链退火，所获siRNA双链复合体用T4 DNA连接酶连接入载体pSilencerTM 4.1CMV neo，克隆转化，挑单克隆菌落过夜摇菌，常规小提质粒，紫外分光光度计测量A260 nm/A280 nm，估算其浓度及有无蛋白核酸污染. 所提质粒行HindⅢ, BamHⅠ双酶切，酶切产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶成像系统观测结果并照相. 全部载体行测序鉴定.1.2.3细胞培养和转染RAW264.7细胞在含100 mL/L胎牛血清、抗生素、谷氨酰胺的RPMI1640 (Hyclone, Logan, Utah)培养基中，37℃ 50 mL/L CO2培养，每隔2～3 d传代1次，实验选用对数生长期细胞.转染用试剂为siPortXP1，按照说明书步骤进行. 设立两个对照组：正常对照组（未行转染的正常RAW264.7细胞组）和pNC转染对照组.1.2.4RTPCR采用Trizol提取RAW264.7细胞(1×106)RNA，RTPCR用一步法试剂盒进行，50 μL PCR反应体系：25 μL 2×反应混合液，5 μL模板RNA，上游引物及下游引物各1 μL，2 μL SuperScript III/Platinum Taq Mix, 0.5 μL RNA酶抑制剂，15.5 μL DEPC处理水. 整个反应在MyCycler thermal cycler (BioRad, USA)上进行，GAPDH为内参照. 扩增参数：58℃ 30 min, 94℃ 2 min, 1个循环；94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 1 min，25个循环；68℃ 5 min. DL2000确定PCR产物大小，12 g/L琼脂糖凝胶电泳，置凝胶成像系统成像，UVP LabWork 4.0软件进行半定量分。