基因工程dna诱变.ppt

第十章 DNA诱变,突变是研究基因结构与功能的最基本手段经典方法：分离自发突变体，或用物理、化学因子处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因 体外诱变：在试管中对DNA进行诱变，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因 用于基因工程、蛋白质工程等研究第一节 随机诱变,体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基突变特点：没有针对性，随机引入突变； 方法：易错PCR 、盒式诱变、增变菌株、化学诱变； 用途：改变基因的编码区，使得蛋白质的氨基酸序列发生改变一、易错PCR (error-prone PCR),概念：在PCR反应中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，得到随机突变的DNA群体，再用载体克隆突变基因 易错PCR采用的方法：,增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对； 加入0.5mM的MnCl2，降低pol对模板的特异性； pol量加到5U，促使在错配碱基处继续延伸； 限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种核苷酸的一种； 3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与C、T、A配对）； dCTP和dTTP的浓度加到1mM，促进错误掺入； 使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。

二、盒式诱变,,盒式取代诱变 混合寡核苷酸诱变,盒式取代诱变,,种类,盒式取代诱变：从载体中切除特定的dsDNA片段，用突变的DNA片段取代混合寡核苷酸诱变,混合寡核苷酸诱变：在人工合成DNA链的过程中，随机引入突变的碱基，得到混合的双链DNA的过程三、增变菌株的诱变作用,概念：与DNA错配修复和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率升高，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）四、化学诱变,用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的DNA群体克隆到合适的载体中，构建成一个重组突变体库这类化合物具有与DNA碱基类似的结构如： 5-溴尿嘧啶（BU） 为胸腺嘧啶（T）的类似物 2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物 马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体,核酸碱基类似物,第二节 定向诱变（定向进化）,定向进化：一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变，最终获得满足人们需要的性能改良的蛋白质 是一种依赖序列同源性的DNA体外重组技术 又称为试管进化、有性PCR (sexual PCR)、分子育种PCR (molecular breeding PCR)。

优点：可以将大量有益突变快速组合，加速产生DNA序列多样性 使进化从以往的“突变—选择”模式变为与自然进化更为相似的“突变—重组—选择”模式定向进化的原理,定向进化与自然进化的异同点：,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用 定向进化使进化朝着人们需要的方向发展动力不同：保守突变 & 非保守取代； 方向不同：适应突变的积累 & 定向突变的积累； 速度不同：非常漫长 & 时间短甚至几天； 目标不同：适应环境 & 探索蛋白质的可塑性两者的不同：,一、DNA改组/洗牌（DNA shuffling）,美国Stemmer 于1994 年首次提出 DNA shuffling技术：从易错PCR获得的正向突变库中分离的DNA片段经过超声波处理或在DNaseⅠ的作用下随机切成小片段，经过不加引物的多次PCR循环在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因其结果是导致不同基因片段之间的重组DNA改组原理,DNA shuffling技术的优点： ①对操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb ，操作简单; ②在短时间内通过多轮重组，积累所有有益的突变 ③比随机突变显著提高了正向突变的概率。

二、交错延伸重组 （staggered extension process, StEP）,,交错延伸重组是一种简化的DNA shuffling技术交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短反应时间以突变体库dsDNA为模板，以单引物进行延伸，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与不同模板退火而继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段三、随机引发重组 (random priming in vitro recombination，RPR),RPR以ssDNA为模板，配合一套随机引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，再组装成完整的基因长度 可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组第三节 定点诱变,70年代初Φx174 DNA（ssDNA 5386 bp），当用带琥珀突变的Φx174 ssDNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，观察到“标记获救”现象，即产生野生型噬菌体。

一、寡核苷酸介导定点诱变的基本流程,合成引物(携带所需的突变)，与野生型DNA退火 延伸合成DNA，含有预定的突变 测序，验证突变，保证其他区域没有发生突变 克隆带突变的DNA,,,,二、经典DNA定点诱变,在PCR出现前，利用M13噬菌体可制备ssDNA的特点重组M13可以分别回收到两种形式：dsDNA和ssDNA1.背景知识 大肠杆菌缺陷型： dut-：dUTPase缺陷，不能把dUTP转化为dUMP，导致细胞内积累dUTP，一些dUTP掺入DNA中占据了T的位置 ung-： glycosylase缺陷，UDG酶[尿嘧啶-N-糖基化酶]可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基,（一）Kunkel定点诱变法（又称“U”法）,① Kunkel突变法,Kunkel 法过程包括： ① 当目标 DNA 插入 phagemid 载体并进入 E. coli CJ236 后 ② 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代了胸腺嘧啶） ③ M13K07 辅助下，产生带U的ssDNA ④ 分离ssDNA，与引入突变的 Oligo 复性 ⑤ 在 T7 DNA polymerase 和T7 DNA ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链。

⑥ 感染 dut+ ung+ E. coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了突变位点的子代双链 DNA 而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力二）位点选择诱变，又叫抗生素抗性回复突变法 （altered sites in vitro mutagenesis）,使用了2个引物，一个含有突变位点，另一个是选择性引物，用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因质粒含有一个突变的Amp抗性基因(不能抗Amp) 将目标DNA克隆到载体中 转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒，变性后与两个引物退火 在dNTPs存在时，T4 DNA聚合酶合成新链，用T4 DNA连接酶环化 转化大肠杆菌，在含Amp的培养基上筛选，长出的菌落提质粒，鉴定后送测序,四、PCR介导的定点诱变,优点：,回收率高； 不需ssDNA； 高温降低模板二级结构； 同一试管反应一）大引物PCR诱变 见P180描述,,（二）重叠延伸PCR诱变(overlapping extension PCR),重叠延伸PCR诱变,在基因的中间，针对感兴趣的位点设计带突变位点的正反向引物 其中带突变位点的反向引物与基因5’端的正向引物配对、而带突变位点的正向引物与基因3’端的反向引物配对，分别进行PCR扩增 合并扩增产物，经变性复性，由DNA聚合酶重新合成完整的带突变位点的基因 再通过PCR扩增获得大量的突变基因,（三）重叠延伸剪接技术 见181面描述 （splicing by overlap extension, SOE）,,（四）同源重组法,（五）双向PCR快速定点诱变,思 考 题:,2. 请设计一合理实验，对克隆于载体pUC18 中的某基因内的特定位置碱基序列进行缺失突变，以获得预期的缺失突变体。

名词解释: 定向进化 增变菌株 DNA shuffling 易错PCR,。