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免疫病理学技术 在科研及临床中 的运用及意义广西医科大学 第一附属医院病理科 吕自力 党裔武 周颖川 5356534免疫病理学v一、免疫细胞化学v二、免疫组织化学v三、免疫荧光组织化学一、免疫细胞化学v1、定义：利用已知抗体检测细胞爬片 上细胞是否存在相应的抗原v2、原理：抗体+细胞抗原----显色v3、运用：检测相关基因的表达二、免疫组织化学 Immunohistochemistry, IHCv原 理v使用范围v试剂配置v操作步骤免疫组织化学的原理抗原 + 抗体 ----- 显色原位半定量蛋白用途v临床病理诊断：肿瘤分类诊断上皮来源：CK，EMA间叶来源：Vimentin淋巴组织: LCAv科研：组织抗原表达情况试剂准备切片(防脱片 )多聚赖氨酸, APES一抗多抗or单抗,兔or鼠, 注意种属特异性，针对检 测组织种属检测试剂盒EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）SABC试剂盒（三步法）显色试剂盒DAB试剂盒其他H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬 酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动 物非免疫血清操作步骤组织切片脱蜡，水化PBS洗3次 X 3分钟抗原修复一抗 （37度1h，4度过夜）封闭内源性过氧化物酶PBS洗3次 X 3分钟二抗 （37度30分钟）PBS洗3次 X 3分钟苏木素染核自来水洗DAB显色脱水封片PBS洗3次 X 3分钟高压修复vpH=6.0柠檬酸盐缓冲液 v大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切 片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入 已沸腾的缓冲液中。

v盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽， 从喷汽开始计时，1-2分钟后 胰酶消化抗原修复v于试管中加入一滴的胰酶浓缩剂和三滴稀释 剂（1：3），均匀混合 v在组织切片上滴加100µl（两滴）混匀的酶试 剂v37℃孵育15-20分钟结果分析和判断v（1）判断原则v（2）对照设计v（3）非特异染色v（4）失败的原因及其处置方法（1）判断原则v必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照v抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆v尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘 细胞的阳性表达v对免疫组化标记结果的意义不能绝对化阴性CK—胞浆阳性胞浆阳性细胞核阳性---PCNA胞核阳性胞膜阳性胞膜阳性（2）对照设计v阳性对照：已知阳性表达的组织v自身对照：同一标本中不同组织对照v阴性对照：A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织B、阴性试剂对照：空白对照（3）非特异性染色原因组织内源性成分的干扰：内源性过氧化物酶---白细胞，红细胞内源性生物素---肝、胰、肾组织组织处理不当：内源性过氧化物酶---白细胞，红细胞内源性生物素---肝、胰、肾组织（3）非特异性染色处理方法抗体：纯化，浓度，时间，温度封闭：H2O2， 非免疫动物血清清洗：充分显色：时间其他：脱蜡充分，无干片（4）染色失败的原因及处理方法v试验片：-v阳性对照片：-v阴性对照片：-v空白对照片：-v结果：假阴性v原因： 操作步骤？ 试剂？v试验片：+v阳性对照片：+v阴性对照片：+v空白对照片：+v结果：假阳性v原因： 切片干涸 抗体浓度过高 缓冲液配制不对 冲洗不彻底 显色液配制不对 显色时间过长 载玻片的粘合剂过厚v试验片：+v阳性对照片：+v阴性对照片：-v空白对照片：+v结果：假阳性v原因： 非特异染色，与二抗 交叉反应。

v试验片：+v阳性对照片：+v阴性对照片：+v空白对照片：-v结果：可疑阳性v原因： 阴性对照组织选择不 准确，含有靶抗原v试验片：+v阳性对照片：+v阴性对照片：-v空白对照片：-v结果：阳性v原因： 方法可靠，实验片含 靶抗原阴性对照切片-，阳性对照标本和待检 测切片呈弱阳性原因：标本固定不当抗体试剂问题：浓度、效价低抗原修复不当显色时间短切片染色深或整张切片出现染色v抗体浓度过高v切片显色时间过长v组织没有正确封闭v冲洗不够充分切片出现非特异性背景染色v内源性过氧化物酶、内源性 生物素过多v血清封闭时间过短v抗体不纯v组织片内出血或坏死成分v冲洗不彻底三、免疫荧光及免疫酶标双重或多重免疫荧光标记染色FITC-绿色TRITC-红色绿色+红色---黄色双重或多重免疫酶标记染色双酶双标记紫蓝色：AKP/NBT黄色：HRP/AEC双重或多重免疫酶标记染色单酶双底物HRP-DAB：棕色镍-鈷：黑色上皮：黑色淋巴：棕色抗体名称种属剂剂型预处预处 理阳性定位阳性细细胞Desmin （结结蛋白） 鼠抗人， 单单抗即用胞浆浆肌肉组织组织Cytokeratin （细细胞角蛋 白） 鼠抗人， 单单抗即用胰酶胞膜， 胞浆浆上皮细细胞Ki-67 （增殖细细胞 核抗原） 鼠抗人， 单单抗即用高压压胞核增殖细细胞 （S，G2 ，M期） 。