细菌的简单染色法和革兰氏染色法.docx

实验一细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性二、基本原理1. 简单染色法：用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等2. 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状它是1884年由丹麦医生Gram创立的革兰氏染色法(Gramstain)不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basicdye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色齐1J(decolorisingagent和复染液(counterstain)碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystalviolet)媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的7S精(ethanol)复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、器材大肠杆菌(Escherichiacoli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)s，枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis),藤黄微球菌(Micrococcusluteus),蜡样芽抱杆菌(B.cereu912〜20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14〜16h的枯草芽抱杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚2. 干燥室温自然干燥3. 固定固定时通过火焰2〜3次即可此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态4. 染色5. 1）简单染色法：① 染色滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）吕氏碱性美蓝染色1〜2min；石炭酸复红或草酸钱结晶紫染色约1min② 水洗倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。

③ 干燥自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干④ 镜检涂片干燥后镜检⑤ 2）革兰氏染色法：⑥ 初染加草酸钱结晶紫一滴，约1〜2min,水洗⑦ 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min,水洗⑧ 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20〜30s,立即用水冲净酒精④复染用番红液染1〜2min,水洗⑨ 镜检干燥后，置油镜下观察革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性3）混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应实验二细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法2. 初步了解芽孢和荚膜的形态二、基本原理芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿(malachitegreen或碱性品红(basicfuchsin)在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理，则菌体和芽孢易于区分荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定三、器材枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)，腊样芽抱杆菌(B.cereuS),球形芽抱杆菌(B.sphaericus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)；圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)或胶质芽抱杆菌(B.mucilaginosu9约2d无氮培养基琼脂斜面培养物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。

荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等四、操作步骤(一)荚膜染色技术方法一：(1)将培养24h左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定2)滴加3〜5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上3)用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4~5min这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染10min4)倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止5)用番红水溶液复染1min,水洗6)待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色方法二：（1）取两支洁净的小试管，分别加入0.2mL无菌水，再往一管中加入2~3接种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入2~3接种环的生孢梭菌的菌苔，两管中各自充分混合成浓厚的菌悬液2）在菌悬液中分别加入0.2mL苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3~5min3）用接种环分别取上述混合液2~3环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出4）再用自来水冲洗，滤纸吸干5）取1~2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。

二）荚膜染色技术1. 湿墨水法（ 1）制备菌和墨水混合液加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀 2）加盖玻片将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液 3）镜检用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜2. 干墨水法（1）在载玻片一端滴一滴6％葡萄糖水溶液，取少许培养了72h的圆褐固氮菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30°角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干3）用纯甲醇固定1min4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染30s,以细水流适当冲洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色3. Anthony法（ 1）涂片按常规取菌涂片 2）固定空气中自然干燥不可加热干燥固定 3）染色用1％结晶紫水溶液染色2min 4）脱色以20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液 5）镜检干后用油镜观察菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色实验三鞭毛染色法及活细菌运动性的观察一、目的要求1 .学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。

2 .学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性二、基本原理鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项这要形态特征细菌的鞭毛f艮纤细，其直径通常为0.0k0.02W所以，除了很少数t邹成鞭毛束（由许多根鞭毛构成）的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色单便毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良白LeifsoriOfe法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以区分三、器材苏云金芽抱杆菌（Bacillusthuringierjgs圈单胞菌（Pseudomona$,sp.黄色葡萄球菌；硝酸银鞭包色液，LeifsoriOfe色液，0.0以美蓝水溶液；载ft片，盖玻片，凹载ft片，无菌水，凡士林，显微镜等。

四、操作步骤（一）鞭毛染色技术1 .硝酸银染色法（ 1） 菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a取新配制的营养琼月制面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28~32培养18~30h让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌苔）作染色观察的菌种材料良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落 2） 载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净，沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）（3）菌液的。